重组的转氨酶及其酶制剂和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程与酶工程技术领域，特别是涉及生物催化不对称合成手性中间体的技术领域，更为具体的说是涉及重组的转氨酶及其酶制剂和应用。利用基因工程技术，通过转氨酶工程菌的重组和构建，成功获得了能够应用于(1R，2S)

【技术实现步骤摘要】
重组的转氨酶及其酶制剂和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程与酶工程
，特别是涉及生物催化不对称合成手性中间体的
，更为具体的说是涉及重组的转氨酶及其酶制剂和应用。

技术介绍

[0002]转氨酶又称氨基转移酶，是一类磷酸吡哆醛依赖性的转移酶，在氨基供体存在下能够特异性地将氨基转移到底物酮上，得到相应的手性胺。作为一种绿色催化剂，转氨酶参与的转氨反应过程具有反应简单、绿色环保等优势。
[0003]转氨酶的催化活性与底物具有密切关系。通过对生物催化剂进行分子改造，提高天然酶在某种、某类合成中的催化性能，对于工业化酶法合成应用具有重要的意义。
[0004]替格瑞洛是一种由英国的阿斯利康公司所研发的新型的环戊基三唑嘧啶类口服抗血小板药物，是一种选择性二磷酸腺苷受体拮抗剂，作用于P2Y12ADP受体来抑制ADP介导的血小板活化和聚集，该药于2012年11月获准在中国上市。
[0005](1R,2S)
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(3,4二氟苯基)环丙胺是制备替格瑞洛的关键中间体。目前现有技术中已经公开了该中间体化合物的多种制备方案，但是通过酶法制备替格瑞洛的关键中间体(1R,2S)
‑2‑
(3,4二氟苯基)环丙胺尚未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种新的重组转氨酶工程菌，并获得能够应用在替格瑞洛的关键中间体(1R,2S)
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(3,4二氟苯基)环丙胺手性胺制备中，从而可以显著提高催化活性，高效制备获得目标化合物。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术首先公开了重组转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]进一步地，本专利技术还公开了所述重组转氨酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]同时，本专利技术还公开了一种重组菌株，所述重组菌种表达如SEQ ID NO：1所示的重组转氨酶。
[0010]进一步地，所述的重组菌株是以pET
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30a质粒为表达载体表达重组转氨酶。
[0011]进一步地，所述的重组菌株是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞。
[0012]进一步地，所述重组菌株是将如SEQ ID NO：2所示的转氨酶基因连接到pET
‑
30a质粒的BamH I和XhoI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中形成。
[0013]同时本专利技术还公开了包含有上述重组菌种发酵生产得到的转氨酶的酶制剂。
[0014]进一步地，本专利技术还公开了重组菌种发酵生产转氨酶的方法，具体步骤为，将转氨酶重组菌株种子液按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃诱导14h，即转氨酶发酵液。
[0015]最后，本专利技术还公开了利用前述重组菌种发酵生产转氨酶的方法获得的转氨酶在
催化酮类化合物转氨反应制备手性胺中的应用，所述酮类化合物是指式II化合物或其类似化合物，
[0016][0017]并且具体地，在本专利技术中还具体的公开了所述转氨酶在制备替格瑞洛手性中间体化合物的应用，合成工艺路线如下所示：
[0018][0019]本专利技术利用基因工程技术，通过转氨酶工程菌的重组和构建，成功获得了能够应用于(1R，2S)
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(3,4_二氟苯基)环丙胺中手性胺制备的工程菌。通过这种方法制备替格瑞洛中间体化合物(1R，2S)
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(3,4_二氟苯基)环丙胺具有高效、清洁的生产优势，是一种符合现代化绿色生产要求的工业生产方法。
附图说明
[0020]图1为Recombinant
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01质粒结构图。
具体实施方式
[0021]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0022]基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]实施例1转氨酶重组菌株的构建
[0024]设计转氨酶基因的上下游引物P1、P2(如表1所示)，以全基因合成构建的pUC57
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T
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003为模板，通过PCR的方式扩增含有BamH I和XhoI酶切位点的T
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003基因。
[0025]PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，30个循环。PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。
[0026]BamH I和XhoI酶酶切胶回收产物及pET
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30a质粒(表达载体)，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。目的基因T
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003与载体pET
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30a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET
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30a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接。将构建好的载体通过化转技术导入
E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该转氨酶基因的重组工程菌。
[0027]其中，转氨酶基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，转氨酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2。
[0028]表1引物
[0029][0030]实施例2重组菌发酵产酶制备(1R，2S)
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(3,4_二氟苯基)环丙胺
[0031](1)制备转氨酶发酵液
[0032]将实施例1构建的重组菌接种于10mL的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，18℃诱导16h，离心手机菌体，生理盐水洗3次后重悬，进行超声波破碎，获得粗酶液。
[0033](2)酶催化制备(1R，2S)
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(3,4_二氟苯基)环丙胺
[0034]分别称取0.1M pH8.0 Tris
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HCl 50mL。再分别加入10mL的(1)制备的粗酶液和0.2M异丙胺，以及10mg的PLP，混匀。另称取1g的化合物于5mL离心管中，加入5mL的DMSO溶解后再缓慢加入反应瓶中，35℃，220rpm，摇床催化反应。过夜反应后，乙酸乙酯萃取，取上层乙酸乙酯相，送分析检测，经液相检测，手性纯度99％,重结晶后化学纯度：90.07％。
[0035]尽管已本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组的转氨酶，其特征在于：该重组转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种编码权利要求1所述的重组转氨酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌种表达如SEQ ID NO：1所示的重组转氨酶。4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，以pET
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30a质粒为表达载体表达重组转氨酶。5.根据权利要求3或4所述的重组菌株，其特征在于：以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞。6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是将如SEQ ID NO：2所示的转氨酶基因连接到pET
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30a质粒的BamH I和XhoI位点...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙海，邬小兵，魏巍，何文玲，
申请(专利权)人：重庆普佑生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：