特异性结合CD47的抗体、其重组溶瘤病毒及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段。本发明专利技术还提供了一种重组溶瘤病毒，所述溶瘤病毒可操作地插入或包含抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列。根据本发明专利技术所述的重组溶瘤病毒，其中，所述抗CD47抗体包含具有A330L/I332E突变的Fc突变体(ALIE抗体)，即所述抗CD47抗体为αCD47

【技术实现步骤摘要】
特异性结合CD47的抗体、其重组溶瘤病毒及其用途


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种能够特异性结合CD47的抗体或抗原结合片段。本专利技术还涉及一种重组溶瘤病毒，本专利技术还提供了所述抗体或抗原结合片段和所述溶瘤病毒的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。

技术介绍

[0002]CD47最初在20世纪80年代作为卵巢癌的肿瘤抗原被发现，此后，CD47被发现在多种人类肿瘤上表达，包括急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其它实体肿瘤。CD47也称整联素关联蛋白(IAP)，是在人体中由CD47基因编码的跨膜蛋白。它属于免疫球蛋白超家族，可以与整联蛋白、血小板反应素(TSP
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1)以及信号调节蛋白α(SIRPα)相互作用。CD47作为一种可防止巨噬细胞吞噬的信号分子，在人体细胞中广泛表达，并且在多种不同的癌细胞中是过表达的，具有作为某些癌症的治疗靶点的潜力。
[0003]SIRPα(信号调节蛋白α)也是一种跨膜蛋白，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面。肿瘤细胞表面高表达的CD47通过与巨噬细胞表面SIRPα结合，释放“不要吃我”的信号，导致肿瘤组织浸润区的巨噬细胞不但同肿瘤细胞和谐相处，而且还会通过促进肿瘤内血管增殖，抑制效应T细胞发挥作用，促进肿瘤细胞扩增和生长。因此通过阻断肿瘤细胞表面CD47与SIRPα结合所传递的抑制性信号通路，恢复或者加强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，能促进巨噬细胞介导的细胞免疫反应，从而为肿瘤免疫治疗提供新的理论和方法。
[0004]近年来，针对CD47/SIRPα信号通路的各种治疗方式进行了大量研究，例如抗CD47抗体、抗SIRPα抗体、重组SIRPα蛋白、双特异性抗体。其中，CD47阻断性抗体被认为是最有希望的肿瘤治疗方案。人CD47阻断型单抗的有效性已经在多种临床前模型中证实，比如淋巴瘤、膀胱癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、急性淋巴细胞性白血病和急性骨髓性白血病等。相关研究也已证实，利用抗CD47单克隆抗体，在体内特异性结合肿瘤细胞表面高表达的CD47蛋白，能够有效解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，重新恢复机体免疫细胞功能，达到抑制肿瘤生长的效果。
[0005]自发现CD47可以作为新一代肿瘤免疫治疗的靶点以来，针对于该靶点的药物研发从未停止过。但在开发CD47靶点药物的途中，CD47抗体易引专利技术显的贫血、高胆红素血症和血小板减少等副作用，使得不少研究因此碰壁，停止了相关研究试验。这是由于CD47在红细胞表面也广泛表达，CD47抗体药物或SIRPα
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Fc融合蛋白与红细胞结合后引起红细胞凝集继而引发红细胞的破裂；同时，其Fc段介导的细胞毒作用进一步引发红细胞的裂解，最终导致贫血的发生。除了明显的贫血等副作用外，CD47抗体仍存在抗体亲和力，免疫原性，抗肿瘤作用等方面不足的问题，因此，亟待效果更佳的该靶点候选抗体的开发。
[0006]近年来，溶瘤病毒治疗肿瘤的研究获得领域极大关注。因为溶瘤病毒自身或经过基因修饰对肿瘤具有很好的靶向性，能够在肿瘤局部感染并裂解肿瘤细胞。另外溶瘤病毒
可作用于多个细胞通路，以此减少肿瘤的抗性，还可以诱导不同形式的细胞死亡。同时打破肿瘤微环境的免疫耐受进而诱导长效肿瘤特异性免疫应答。借助溶瘤病毒将CD47的抗体蛋白转运到肿瘤组织，发挥CD47抗体的抗肿瘤生物效应，既可有效地避免CD47抗体与外周血红细胞结合而引发贫血的风险，增加了肿瘤免疫治疗的安全性。又可联合溶瘤病毒发挥多重的抗肿瘤作用，从而显著提升了肿瘤免疫治疗的效果。
[0007]溶瘤病毒治疗肿瘤的研究获得领域极大关注，其优势在于：溶瘤病毒可通过多种机制联合杀伤肿瘤细胞以减少肿瘤的抗性；可发挥免疫调节作用打破肿瘤微环境的免疫耐受进而诱导长效肿瘤特异性免疫应答；能够转运治疗性蛋白进入肿瘤组织并随病毒复制而在恶性肿瘤细胞提升表达水平。
[0008]溶瘤病毒临床研究和治疗在20世纪50年代和70年代出现过短暂的热潮，初期所采用的溶瘤病毒为野生型，临床试验中虽然显示出一定的抗肿瘤效果，但同时也诱导了过强的免疫反应与并发症，以致领域一度几乎中断了溶瘤病毒的研发。20世纪90年代基因工程技术的发展，加速了溶瘤病毒基因改造与优化，极大提高了溶瘤病毒治疗肿瘤的特异性、有效性和安全性，该疗法再次获得了研究者的广泛关注。目前溶瘤病毒的类型主要有：腺病毒、单纯疱疹病毒
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1、新城疫病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、痘苗病毒等，其中以腺病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒临床应用最为广泛。
[0009]2006年，溶瘤腺病毒产品(oncorine)已在中国用于临床治疗鼻咽癌等。该溶瘤病毒删除了人5型腺病毒的E1B
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55kD基因，可在p53基因突变的癌细胞中复制增殖并杀伤宿主细胞，产生溶瘤治疗作用；同时删除E3区，使肿瘤抗原信息能通过树突细胞的传递而激活T细胞的免疫。但临床数据显示，相较于放射治疗，溶瘤病毒oncorine联合化疗对鼻咽癌患者的治疗效果较弱。
[0010]2015年，安进公司的溶瘤单纯疱疹病毒(talimogene laherparepvec，T
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VEC)获得美国FDA批准用于治疗黑色素瘤，同年12月又获得欧盟批准用于首次手术后复发的黑色素瘤患者不可切除的皮肤、皮下和淋巴结病灶的局部治疗。T
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VEC临床研究结果极大地推动了溶瘤病毒在肿瘤治疗领域的研发进程。但是通过瘤内给药方式限制了治疗类型，只能应用在离体表近的便于手术的肿瘤类型中，对很多非浅表的实体瘤及转移瘤的治疗存在给药困难和治疗不彻底的问题，若能证实通过静脉给药仍具有较好的肿瘤治疗效果，将极大地提高其临床应用价值；由于疱疹病毒自身溶瘤作用的限制性，对体积大和/或转移的肿瘤清除不完全，所以还需要联合其他治疗手段来增强抗肿瘤作用。
[0011]痘苗病毒(Vaccinia virus，VV)的生物学性状和致病机制相对明晰，在消除天花的过程中起到了关键作用，它在人体的安全性也得到了充分证明。根据致病性，宿主范围等特点，痘苗病毒可分为WR(Western reserve)株、Wyeth株、Copenhagen株、Lister株、Tian Tan株等。因其具有宿主范围广，保守性高，安全性好及外源基因容量大等特点，痘苗病毒被用于流感病毒、人类免疫缺陷病毒等多个重组疫苗的载体。作为溶瘤病毒的研发，目前大多数处于临床前研究阶段，只有少数进入临床研究阶段。
[0012]利用痘苗病毒作为溶瘤病毒治疗肿瘤的研究，目前进展最快的是美国Jennerex公司研发的Pexa
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Vec(JX
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594)。JX
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594基于Wyeth株病毒，在TK区插入hGM
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CSF和LacZ基因，由于缺失胸腺激酶基因，JX
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594可在高水平表达胸腺激酶的癌细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含下述3个互补决定区的重链可变区：(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；和/或(b)包含下述3个互补决定区的轻链可变区：(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:24中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；优选地，(i)
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(vi)任一项中所述的置换为保守置换；优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:17所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:18所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:12所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:13所示的VL CDR3；或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:16所示的VL CDR3；或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:22所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:23所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:24所示的VL CDR3。2.能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9所示的重链可变区中含有的3个CDR；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5、7或25所示的轻链可变区中含有的3个CDR；优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:9所示的序列；(ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或(iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的
序列同一性的序列；和/或，(b)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：(iv)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列；(v)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或(vi)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:5、7或25中任一项所示的序列的VL。4.权利要求1
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3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：(a)人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换；优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，更优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，进一步优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。5.权利要求1
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4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab
’
、(Fab
’
)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体和单域抗体；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体；更优选地，所述抗体为完全人抗体。6.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1
‑
5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区；优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO:6、8、10或26中任一项所示的核酸序列。7.一种载体，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体；更优选地，所述载体为病毒；进一步优选地，所述载体为克隆载体AbVec
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hIgKappa或者克隆载体AbVec
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hIgG1。8.宿主细胞，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子或权利要求7所述的载体；优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的；更优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片段、多特异性抗体的其它细胞；进一步优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞；更进一步优选地，所述宿主细胞为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞；最优选地，所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。9.制备权利要求1
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5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许权利要求1
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5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求8所述的宿
主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。10.一种重组溶瘤病毒，所述溶瘤病毒可操作地插入或包含抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列；优选地，所述基因编码序列位于所述重组溶瘤病毒的胸腺嘧啶核苷激酶区。11.根据权利要求10所述的重组溶瘤病毒，其中，所述抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列可单独表达、也可与其他基因或片段融合表达；优选地，用于融合表达的其他基因或片段选自Fc片段，趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCL20或CX3CL1，或霍乱毒素CTA或CTB的一种或多种；优选地，所述重组溶瘤病毒还包含其他免疫调节因子的基因编码序列；更优选地，所述其他免疫调节因子选自IL
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1、IL
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2、IL
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3、IL
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐建青，张晓燕，丁相卿，廖启彬，张丹，
申请(专利权)人：上海鑫湾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：