一种抗MIC的人源化单链抗体、免疫吸附剂及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种抗MIC的人源化单链抗体、其编码基因、表达载体、宿主、结合物或偶联物、吸附剂剂其用途，本发明专利技术提供的人源化单链抗体可以特异性结合人血液或血浆中的NKG2D配体，而解除可溶性MIC蛋白异常升高引起的肿瘤免疫抑制作用。本发明专利技术提供的人源化单链抗体，与传统抗体相比，具有分子量小、稳定性强、低免疫原性、成本低、易于表达且表达量高，适合于大规模生产。本发明专利技术将人源化单链抗体与固相载体相结合，吸附效率高，吸附性能稳定，对血浆中的其他蛋白非特异性吸附量低，特异性好，在临床治疗上安全性能好、经济效益高。而且，本发明专利技术提供的人源化单链抗体降低了吸附配基脱落引起的副作用，提高了安全性。提高了安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种抗MIC的人源化单链抗体、免疫吸附剂及其用途


[0001]本专利技术涉及抗体
，具体是一种抗MIC的人源化单链抗体、免疫吸附剂及其用途。

技术介绍

[0002]NKG2D是一种同源二聚体II型跨膜C类凝集素受体，其在所有的NK细胞、大部分CD8αβT细胞、NKT细胞和γδT细胞以及少部分具有调节活性的CD4αβT细胞中表达，是肿瘤细胞识别中最重要的激活受体之一(Chitadze et al.2013)。NKG2D受体和配体的相互作用可以激活免疫细胞介导的杀伤作用。NKG2D配体在健康的人体组织里通常不表达或低水平表达，但在被感染细胞和癌细胞的细胞膜表面高水平表达。在人类中，NKG2D配体包括MICA和MICB(I类MHC链相关蛋白A和B)，它们都被MHC的基因编码，基因序列有84％相同(Liet al.1999)。MICA和MICB可从肿瘤细胞表面释放，形成可溶性MICA和MICB(简称sMIC)，sMIC通过下调NKG2D的表达抑制NK细胞和T细胞对肿瘤细胞的识别与杀伤，从而导致肿瘤发生免疫逃逸。MICA和MICB都具有高度多态性，目前已发现MICA的蛋白变异体有192种，在中国，80％以上的人群的基因型为MICA*002、008、009、010、012；MICB的蛋白变异体为42种，在世界各国人群分布的同源性比MICA高，其中MICB*005是频率最高的。
[0003]可溶性MIC在肿瘤病人血液中的存在与其对效应细胞的抑制作用，使之成为一个潜在的抗肿瘤靶点。库利南公司在CN112566659A/CN113056484A公开了抗MICA/B抗体靶向MIC蛋白的α3结构域，其可以结合膜结合型的MICA*004以及重组的游离MICA*001、002、004、008、009和MICB，并且能抑制PLC/PRF/5肝癌细胞表面MICA的脱落。Jennifer Wu等以MICB为抗原，开发了抗MIC抗体，该抗体用于可生成可溶性MICB的转基因小鼠构建的肿瘤模型中，能提高肿瘤微环境的免疫活性，降低肿瘤的质量并抑制其转移，同时没有引起明显的系统性毒性。CN110088137A、WO2014140884A2及US20200165343A1等公开了能够结合MICA/B的抗体，主要结合MICA/B蛋白的α3结构域，可有效结合MICA*002、008、009、018和MICB*005，并与免疫细胞的CD16结合，进一步提高毒性，但该抗体不能增强NK细胞对以外泌体形式释放MIC的肿瘤细胞的毒性。CN108779178A公开了一种抗MICA抗体，该抗体结合NKG2D结合表面附近的MICA侧面的α2结构域，可结合MICA*001、004、007、008。单抗药物需要的剂量都比较大，大剂量输入抗体药物也存在一定的安全风险。
[0004]血液净化是指把患者血液引出体外并通过一种净化装置，除去其中某些致病物质，净化血液，从而治疗疾病的过程。吸附是血液净化的清除致病物质的重要原理之一，免疫吸附是将具有高度特异性的抗原、抗体或具有特定理化亲和力的物质(配基)与吸附材料结合，制成吸附柱，使其可以选择性或特异性地吸附体内相应的致病因子。在与药物的联合治疗中，免疫吸附可增强机体对药物治疗的敏感性，使药物疗效增加，副作用减少，缩短疗程，降低复发率。近年来，免疫吸附已经成功用于自身免疫性疾病、炎症风暴、脓毒症等的治疗，也有望用于恶性肿瘤的治疗。US9707333以雪花莲凝集素、抗Fas抗体或适配体为吸附配基，将其偶联到琼脂糖微球、聚丙烯酸酯微球或中空纤维上，结合膜分离和免疫吸附技术清
除肿瘤衍生外泌体，恢复机体对肿瘤细胞的免疫监视。有文献用蛋白A免疫微球吸附抗MICA抗体和抗MICB抗体制备成免疫吸附剂，该免疫吸附剂能有效清除头颈鳞状细胞癌病人血浆样品中的游离MICA和MICB，并且用吸附剂处理后的血浆孵育的NK细胞的抗肿瘤活性得以恢复。该课题组还将抗MICA抗体偶联到微球上制成免疫吸附剂，经过三次完整血浆体积的交换后，该吸附剂能有效清除注射至恒河猴血浆里的重组可溶性MICA*004(Sandra Weil et al.2017)。CN112574311A开发的鼠单抗和基于其可变区序列设计的单链抗体对MICA*002、008、009、010和MICB*005都有结合活性，以鼠单抗和单链抗体为吸附配基制备成的免疫吸附剂对以上5种MIC蛋白都有吸附性能。但是，鼠单抗和单链抗体的序列都是鼠源性的，鼠源性的配基脱落进入人体会对机体造成免疫副反应。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种抗MIC的人源化单链抗体、免疫吸附剂及其用途，本专利技术提供的人源化单链抗体对NKG2D配体具有良好的吸附性能，降低了吸附配基脱落引起的副作用，提高了安全性。
[0006]本专利技术提供了一种抗MIC的人源化单链抗体，包括轻链(VL)和重链(VH)，所述轻链和重链的氨基酸序列包括：
[0007](I)、所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1～3所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4～6任一所示；
[0008]或者
[0009](II)、(I)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
[0010]或者
[0011](III)、与(I)或(II)所述氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
[0012]在一些具体的实施方式中，所述人源化单链抗体还包含连接子序列(Linker)。
[0013]在一些具体的实施方式中，所述连接子序列由氨基酸G/S组成。
[0014]在一些具体的实施方式中，所述连接子序列为(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n或(GGGGS)n，n＝1～5。
[0015]在一些具体的实施方式中，所述连接子序列为(GS)5、(GGS)2、(GGS)4、(GGGS)4、(GGGS)3、(GGGGS)1、(GGGGS)3或(GGGGS)4。
[0016]在一些具体的实现方式中，所述抗体的分子结构为VH
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linker
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VL或VL
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linker
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VH。
[0017]在一些具体的实现方式中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4～6任一所示；
[0018]或者所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4～6任一所示；
[0019]或者所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4～6任一所示。
[0020]具体而言，在一些实施例中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述连接子序列为(GGGGS)1；
[0021]或者所述轻链的氨基酸序列如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗MIC的人源化单链抗体，其特征在于，包括轻链和重链，所述轻链和重链的氨基酸序列包括：(I)、所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1～3所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4～6任一所示；或者(II)、(I)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或者(III)、与(I)或(II)所述氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的人源化单链抗体，其特征在于，还包含连接子序列。3.根据权利要求2所述的人源化单链抗体，其特征在于，所述连接子序列由氨基酸G/S组成。4.根据权利要求3所述的人源化单链抗体，其特征在于，所述连接子序列为(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n或(GGGGS)n，n＝1～5；所述连接子序列优选为(GS)5、(GGS)2、(GGS)4、(GGGS)4、(GGGS)3、(GGGGS)1、(GGGGS)3或(GGGGS)4。5.根据权利要求1～4任意一项所述的人源化单链抗体，其特征在于：所述抗体的分子结构为VH
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VL或VL
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VH。6.根据权利要求5所述的人源化单链抗体，其特征在于，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4～6任一所示；或者所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4～6任一所示；或者所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4～6任一所示。7.根据权利要求6所述的人源化单链抗体，其特征在于，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述连接子序列为(GGGGS)1；或者所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述连接子序列为(GGGS)4；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述连接子序列为(GGGS)3；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述连接子序列为(GGS)4；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述连接子序列为(GGGGS)2；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述连接子序列为(GGGGS)3；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述连接子序列为(GGGS)4；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.5所
示，所述连接子序列为(GGS)2；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示，所述连接子序列为(GS)5。8.根据权利要求7所述的人源化单链抗体，其特征在于，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述连接子序列为(GGGGS)1，所述抗体结构为VH
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VL；或者所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述连接子序列为(GGGS)4，所述抗体结构为VL
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VH；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述连接子序列为(GGGS)3，所述抗体结构为VH
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨睿祯，李家萍，陈思锐，杨正根，张海珍，陈校园，
申请(专利权)人：广州康盛生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：