用于针对癌症及传染病的免疫疗法的融合蛋白制造技术

本发明专利技术揭露用于针对癌症及传染病的免疫疗法的融合蛋白。根据本发明专利技术的融合蛋白包含CD40结合域；抗原；以及定位在所述CD40结合域与所述抗原之间的易位域，其中，在所述融合蛋白中在所述CD40结合域与所述易位域之间存在弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点。所述抗原是病原体的抗原或肿瘤抗原。所述弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点允许经由弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解而将所述CD40结合域自所述融合蛋白移除。本发明专利技术亦揭露本发明专利技术的融合蛋白的医药组合物、表达载体及用途，其用于引起抗原特异性细胞介导的免疫反应、治疗需要此治疗的受试者的肿瘤及/或由病原体所致的疾病。病。病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于针对癌症及传染病的免疫疗法的融合蛋白


[0001]本专利技术大体涉及融合蛋白，且更详而言，涉及用于引起针对肿瘤及传染病的T细胞介导的免疫反应的融合蛋白。

技术介绍

[0002]适应性免疫系统包括体液性免疫组分及细胞介导的免疫组分两者并且摧毁入侵的病原体。完成适应性免疫反应的细胞系被称为淋巴细胞的白细胞。两种不同类型的淋巴细胞，B细胞及T细胞完成主要活性：抗体反应及细胞介导的免疫反应。适应性免疫藉由暴露于病原体而活化并且导致未来遭遇所述病原体时的免疫反应增强。疫苗诱导适应性免疫细胞中的抗原特异性记忆，使得针对标靶病原体的保护成为可能。仍需要新颖的治疗性疫苗以治疗包括癌症及由病原体造成的传染病的疾病。

技术实现思路

[0003]在一方面，本专利技术涉及一种融合蛋白，其包含：(a)CD40结合域；(b)抗原；以及(c)定位在所述CD40结合域与所述抗原之间的易位域；其中，在所述融合蛋白中在所述CD40结合域与所述易位域之间存在弗林蛋白酶(furin)及/或组织蛋白酶(cathepsin)L裂解位点。
[0004]在另一方面，本专利技术涉及一种编码根据本专利技术的融合蛋白的DNA片段。本专利技术亦涉及一种表达载体，其包含编码本专利技术的融合蛋白的DNA片段。
[0005]在还一方面，本专利技术涉及一种医药组合物，其包含本专利技术的融合蛋白及医药上可接受的载剂及/或佐剂。
[0006]在又一方面，本专利技术涉及本专利技术的融合蛋白或医药组合物在制造药物的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中引起抗原特异性细胞介导的免疫反应、治疗肿瘤及/或由病原体所致的疾病。本专利技术亦涉及本专利技术的融合蛋白或医药组合物，其用于引起抗原特异性细胞介导的免疫反应、治疗需要此治疗的受试者的肿瘤及/或由病原体所致的疾病。
[0007]替代性地，本专利技术涉及一种用于引起抗原特异性细胞介导的免疫反应、治疗需要此治疗的受试者的肿瘤及/或由病原体所致的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本专利技术的融合蛋白或医药组合物施用至需要此治疗的受试者。
附图说明
[0008]图1是载体图谱。
[0009]图2是载体图谱。MCS，多克隆位点。
[0010]图3是载体图谱。
[0011]图4是载体图谱。
[0012]图5A至图5E是示出本专利技术的各种实施方式的示意图。
[0013]图6是显示每一动物群组中相对细胞因子诱导的图。
[0014]图7是显示来自每一动物群组的脾细胞中的IFN
‑
γ
+
免疫斑点的图。
[0015]图8是显示每一动物群组中血清HPV
16
E7特异性抗体量级的图。
[0016]图9是显示每一动物群组中血清HPV
18
E7特异性抗体量级的图。
[0017]图10显示免疫接种程序表以及分别未经治疗及经所指示的融合蛋白治疗的动物群组。
[0018]图11是显示经或未经所指示的融合蛋白治疗的每一动物群组中的肿瘤尺寸的图。
[0019]图12是显示经或未经所指示的融合蛋白治疗的每一动物群组中的存活率的图。
[0020]图13是显示经或未经所指示的融合蛋白治疗的每一动物群组中的无肿瘤率的图。
[0021]图14是显示经或未经所指示的各种剂量的融合蛋白18sCD40L
‑
T
PE
‑
E7治疗的每一动物群组中的肿瘤尺寸的图。
[0022]图15是显示经或未经所指示的各种剂量的融合蛋白E7
‑
T
Stx
‑
18sCD40L治疗的每一动物群组中的肿瘤尺寸的图。
[0023]图16显示免疫接种程序表(上图)、动物群组及相应的融合蛋白HBx
‑
preS1
‑
T
Stx
‑
18sCD40L给药程序表(下图)。
[0024]图17是显示来自图16中每一动物群组的脾细胞中的IFN
‑
γ
+
免疫斑点的图。
[0025]图18是显示图16中每一动物群组中血清HBx特异性抗体量级的图。
具体实施方式
[0026]除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语具有与具有本专利技术所属领域通常知识的人士所一般理解者相同之意。此外，详述下列定义以例示性说明并且这些定义用来揭示本专利技术的各种术语的意义及范畴。
[0027]定义
[0028]抗原呈递细胞(APC)或辅助细胞是将与主要组织兼容复合体(MHC)复合的抗原展示在其表面的细胞；这一制程称为抗原呈递。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)来识别此等复合体。APC加工抗原并将它们呈递至T细胞。
[0029]抗原呈递细胞落入两个类别：专职性及非专职性。彼等表达MHC II类分子与共刺激性分子及模式识别受体，它们一起被称为专职性抗原呈递细胞。专职性抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞(DC)、巨噬细胞及B细胞。非专职性APC表达MHC I类分子，其包括身体中全部类型的有核细胞。
[0030]专职性APC专门将抗原呈递至T细胞。它们在下列者中非常有效：内化抗原(无论藉由吞噬作用或藉由受体介导的胞吞作用)、将抗原加工为肽片段以及随后将彼等肽(已结合至MHC II类分子)展示在其细胞膜。T细胞识别抗原呈递细胞的细胞膜上的抗原
‑
MHC II类分子复合体并与之相互作用。随后，藉由抗原呈递细胞产生额外的共刺激讯号，导致T细胞的活化。全部的专职性APC皆亦表达MHC I类分子。
[0031]专职性APC及非专职性APC使用MHC I类分子将内源性肽展示在细胞膜。此等肽起源于所述细胞自身之内，与使用MHC II类分子的专职性APC所展示的外源性抗原相反。细胞毒性T细胞能够与藉由MHC I类分子呈递的抗原相互作用。
[0032]CD40是在抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞及B细胞)上表达的共刺激性蛋白。CD40L与CD40的结合活化抗原呈递细胞并且诱导多种下游效应。CD40是癌症免疫疗法的药物标靶。
[0033]术语“CD40结合域”是指可识别并结合CD40的蛋白质。CD40结合域可以选自下列中一者：“CD40配体(CD40L)或其功能性片段”、“抗CD40抗体或其功能性片段”。
[0034]术语“CD40L”、“CD40配体”与“CD154”可互换。CD40L结合抗原呈递细胞(APC)上的CD40(蛋白)，这导致多种取决于标靶细胞类型的效应。CD40L在经由T细胞启动的免疫反应的共刺激及调节以及表达CD40的免疫细胞的活化中发挥关键作用。US 5,962,406揭露了CD40L的核苷酸及氨基酸序列。
[0035]术语“抗CD40抗体”及“CD40特异性抗体”可互换
[0036]当术语“实质由...组成”或“实质上由...组成”用来描述多肽的氨基酸序列时，其意指所述多肽可以具有或可以不具有位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白，其包含：(a)CD40结合域；(b)抗原；以及(c)易位域，其定位在所述CD40结合域与所述抗原之间；其中，在所述融合蛋白中在所述CD40结合域与所述易位域之间存在弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述易位域是假单胞菌外毒素A(PE)易位肽，并且所述CD40结合域定位在所述融合蛋白的N端。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述易位域是由长度为26至112个氨基酸残基组成的PE易位肽，所述PE易位肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述易位域是志贺毒素(Stx)易位肽，并且所述抗原定位在所述融合蛋白的N端。5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述易位域是由长度为8至84个氨基酸残基组成的Stx易位肽，所述Stx易位肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。6.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点允许经由弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解而将所述CD40结合域自所述融合蛋白移除。7.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。8.如权利要求1所述的融合蛋白，其进一步包含肽接头，所述肽接头包含所述弗林蛋白酶及/或组织蛋白酶L裂解位点，所述裂解位点定位在所述CD40结合域与所述易位域之间。9.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述CD40结合域是CD40配体(CD40L)或其功能性片段。10.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述CD40结合域是CD40配体(CD40L)或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的其功能性片段，所述CD40L或其功能性片段具有154至261个氨基酸残基的长度。11.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述CD40结合域是CD40特异性抗体或其结合片段，或单链可变片段(scFv)，所述CD40特异性抗体或scFv包含V
H
及V
L
，其中：(a)所述V
H
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；并且(b)所述V
L
包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。12.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述CD40结合域是CD40特异性抗体或其结合片段，所述CD40特异性抗体包含V
H
及V
L
，所述V
H
包含V
H CDR1、V
H CDR2及V
H CDR3；并且所述V
L
包含V
L CDR1、V
L CDR2及V
L CDR3，其中：(i)所述V
H CDR1、V
H CDR2及V
H CDR3分别包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:26的氨基酸序列；并且(ii)所述V
L CDR1、V
L CDR2及V
L CDR3分别包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29的氨基酸序列。13.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述抗原是肿瘤抗原，所述肿瘤抗原选自由下列所组成的群组：...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴嘉茂，
申请(专利权)人：萨摩亚商柏沛生医股份有限公司，
类型：发明
国别省市：