抗人CD40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用技术

本申请公开了抗人CD40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用。以商品化的人CD40蛋白作为免疫原，基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，制备该抗人CD40蛋白兔单克隆抗体，经检测，与人CD40蛋白具有较强的亲和力，达到7.2

【技术实现步骤摘要】
抗人CD40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及抗人CD40蛋白单克隆抗体、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]人CD40蛋白是一种I型跨膜糖蛋白，由N端信号肽(20aa)、胞膜外区(193aa)、跨膜区(22aa)和胞浆区(62aa)组成。CD40蛋白广泛表达于免疫细胞表面，包括B细胞、T细胞，单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，是细胞表面重要的功能蛋白，参与多种免疫细胞的激活。同时也表达于部分非免疫细胞的表面如上皮细胞。另外，CD40还表达于白血病B细胞上，且在某些癌症细胞，比如上皮癌细胞表面也有表达。
[0003]人CD40蛋白的配体CD40L(也称CD154)，CD40L主要表达于活化的CD4+T淋巴细胞表面，提供B淋巴细胞活化所必需的协同刺激信号。受体细胞被激活后，表达在细胞表面的CD40L随后会被切下来流入血液，产生一个仍具有生物活性、可溶性的、三聚态的片段，又称为可溶性CD40L。
[0004]CD40
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CD40L共刺激途径对于胸腺依赖的体液免疫十分重要，B细胞的激活，分化以及免疫记忆都离不开该共刺激途径。同时对激活抗原提呈细胞(APC)也非常重要，是T细胞激活的关键。
[0005]其他表达CD40蛋白的免疫细胞被激活后，会分泌多种的细胞因子，发挥不同的免疫功能。比如，巨噬细胞会分泌TNF
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α，树突状细胞和巨噬细胞会分泌白细胞介素12，这些细胞因子对与T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫作用十分重要。
[0006]正是因为CD40蛋白在免疫系统中发挥的重要作用，使得CD40蛋白成为免疫细胞共刺激分子中最有潜力的靶点之一。国内外制药企业都有布局CD40激动剂抗体的开发，目前进入临床二期7个，临床一期6个，主要适应症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌等，用药方式有单独用药，也有和其他治疗方式联合用药。
[0007]现有技术中的CD40激动剂抗体大多源于鼠单克隆抗体，亲和力相对较弱。因此，本领域亟需开发一种新的高亲和力、高激活活性的单克隆抗体，给基于CD40靶点的治疗性抗体提供新的选择。

技术实现思路

[0008]本申请提供一种抗人CD40蛋白的高亲和力兔单克隆抗体，以在一定程度上解决上述技术问题之一。该兔单克隆抗体能够识别人CD40蛋白，该抗体和重组表达的人CD40蛋白结合的亲和常数为7.2
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M。该抗体能够和人B细胞表面表达的CD40蛋白结合，并且激活B细胞，相同实验条件下，激活效果优于CD40L。所述的抗人CD40蛋白兔单克隆抗体的免疫原为商品化的人CD40蛋白；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。所述单克隆抗体能够可特异性结合人CD40蛋白，因此，可用所述单克隆抗体应用于制备检测人CD40蛋白的试剂盒，以达到人CD40蛋白检测或相关疾病诊断的临床应用价值，为实
现此目的，本申请提供了如下技术方案：
[0009]第一方面，本申请提供了一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体包含根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
[0010]和/或
[0011]包含根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VH CDR3，其由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；优选地，所述置换为保守性置换。
[0012]第二方面，本申请提供了一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)；所述轻链可变区(VL)由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成；所述重链可变区(VH)由SEQ ID NO:4所示氨基酸序列组成。
[0013]第三方面，本申请提供了一种抗体，其包含轻链和重链，所述轻链由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成；所述重链由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成。
[0014]第四方面，本申请提供了一种缀合物，其包含第一至第三方面任一项所述的抗体，及与所述抗体连接的可检测的标记。
[0015]第五方面，本申请提供了一种试剂盒，用于检测人CD40蛋白，所述试剂盒包括第一至三方面任一项所述的抗体或第四方面所述的缀合物。
[0016]第六方面，本申请公开了一种人CD40蛋白激动剂，所述蛋白激动剂包括第一至第三方面任一方项所述抗体，所述蛋白激动剂可激活B细胞表达共刺激信号分子(CD86)和抗原呈递分子(MHC
‑Ⅱ
)。
[0017]第七方面，本申请公开了第一至第三方面任一项所述抗体或第五方面所述试剂盒在检测人CD40蛋白的应用。
[0018]与现有技术相比，本申请的优点及积极效果至少如下：
[0019]本申请采用商品化的人CD40蛋白作为免疫原，基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，制备抗人CD40蛋白兔单克隆抗体，经检测，与人CD40蛋白具有较强的亲和力，达到7.2
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M。
[0020]本申请中所提供的抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体，可以用于开发检测人CD40蛋白的流式抗体及相关试剂盒。
[0021]本申请所提供的抗人CD40蛋白的兔单克隆抗体，可以作为人CD40蛋白激动剂激活B细胞使用，该抗体激活的B细胞CD86和MHC
‑Ⅱ
的表达水平，是CD40L激活的B细胞的3～9倍。
附图说明
[0022]图1为本申请实施例提供的人CD40蛋白兔单克隆抗体的亲和力测定结果。
determining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VH和VL的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen
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binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体，其特异性结合人CD40蛋白，所述抗体包含根据Kabat编号系统定义的轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VL CDR1，其由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VL CDR2，其由SEQ ID NO:6所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VL CDR3，其由SEQ ID NO:7所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；和/或包含根据Kabat编号系统定义的重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)具有三个互补决定区(CDRs)，分别为：VH CDR1，其由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；VH CDR2，其由SEQ ID NO:9所示氨基酸序列组成，或与其相比具有1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；以及VH CDR3，其由SEQ ID NO:10...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄阳，黄海斌，程昊，陈嘉琛，彭晓旺，岳涵，
申请(专利权)人：优睿赛思武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：