靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用，所述纳米抗体包括VHH01和VHH02，其对BCMA均具有较强的特异性和较高的亲和力，均能够与BCMA阳性细胞系以高亲和力发生特异性地结合，基于所述纳米抗体构建得到的CAR

【技术实现步骤摘要】
靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体地，本专利技术涉及靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用，更具体地，本专利技术涉及靶向BCMA的纳米抗体VHH01和VHH02、嵌合抗原受体及其应用。

技术介绍

[0002]B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)是一种表达在浆细胞、浆母细胞和骨髓浆细胞的抗原，其不在B细胞或者造血干细胞上表达，BCMA又称为CD269、TNFRSF17，属于TNF受体超家族，是一种由185个氨基酸残基组成的Ⅲ型跨膜蛋白，能够结合B淋巴细胞刺激因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。BCMA的表达与许多癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病相关。BCMA高表达的相关癌症包括一些血液癌症，例如多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和胶质母细胞瘤等。此外，BCMA通过介导下游信号通路，在细胞的存活、增殖、转移和耐药中起着关键性的作用，这些特性使得BCMA成为治疗血液系统肿瘤的有效靶点，特别是对于多发性骨髓瘤的治疗。目前，针对BCMA的新型肿瘤免疫治疗方法主要包括嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T
‑
Cell Immunotherapy，CAR
‑
T)、双特异性抗体(Bispecific antibody，BsAb)药物和抗体药物偶联物(Antibody
‑
drug Conjugate，ADC)，最近的研究也表明了靶向BCMA的CAR
‑
T细胞能够在体内有效清除骨髓瘤细胞。
[0003]CAR
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T是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，其原理在于经嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞可以特异性地识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境、打破宿主免疫耐受状态。CAR是CAR
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T的核心结构，赋予细胞特异性识别肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原的能力，CAR主要由三个功能结构域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，胞外结构域抗原结合区及一段起连接作用的铰链区(Hinge)构成；胞内结构域由共刺激信号结构域(Costimulatory domain)和信号转导结构域(Signaling domain)构成。细胞外的抗原结合区在结合表达于靶细胞表面的靶蛋白后，会激活CAR结构的共刺激信号结构域和信号传导结构域，使得CAR
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T同时具备激活信号和共激活信号，因此可以在杀伤肿瘤细胞的同时实现高效扩增。CAR
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T疗法的有效性依赖于识别抗原的抗体的特异性以及该抗体对抗原结合的亲和力高低等性质。
[0004]目前，CAR T疗法通常以来源于单克隆抗体的scFv段作为抗原结合区，但是scFv的分子量较大而且容易形成多聚体，从而影响CAR的功能，进而影响CAR T细胞的治疗效果。纳米抗体是目前最小的抗体分子，纳米抗体自发现以来，逐渐受到人们关注，已有纳米抗体在自身免疫疾病、血液疾病、病毒感染相关疾病及骨科疾病中的应用，在抗感染、抗炎症性疾病以及抗神经退行性疾病等方面也都表现出了极大的优势。纳米抗体主要的优点：一是分子量小，组织穿透能力强，纳米抗体的大小只有普通抗体的1/10，这使其具有强大的组织穿透能力，甚至可以直接穿透血脑屏障，可提高对实体瘤的治疗效果；二是毒性和免疫原性
低，由于其分子量小、体积小，所以对于宿主的免疫原性和毒性都很低；三是亲和力高，稳定性强，纳米抗体与抗原的亲和力很高，并且纳米抗体性质稳定，易溶于水，抗酸碱能力强；四是组合形式多样，可制成单、双和多功能抗体，实现多靶点的同时打击；五是生产周期短、生产成本低，纳米抗体易于制备，技术稳定后，1
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2年便可成药；六是应用领域广泛可用于疾病治疗、医疗诊断、免疫亲和层析等领域。为了克服传统CAR T疗法中存在的上述技术问题，以及充分利用纳米抗体的上述优点，本专利技术提供了新型的靶向BCMA的纳米抗体VHH01和VHH02，以及包含所述纳米抗体的CAR
‑
T细胞。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，为本领域提供靶向BCMA的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用，所述纳米抗体包括VHH01和VHH02，VHH01和VHH02对BCMA均具有较强的特异性和较高的亲和力，基于所述纳米抗体制备得到的CAR
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T细胞对BCMA阳性细胞系均具有较高的特异性杀伤效率，且对不表达BCMA的细胞系无不良影响，应用前景广阔，在此基础上完成了以下专利技术。
[0006]纳米抗体
[0007]在一个方面，本专利技术提供了靶向BCMA的纳米抗体。
[0008]进一步，所述纳米抗体包括VHH01、VHH02；
[0009]优选地，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示；
[0010]更优选地，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示；
[0011]最优选地，所述VHH01的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0012]最优选地，所述VHH01的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0013]优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15所示；
[0014]更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16所示；
[0015]最优选地，所述VHH02的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
[0016]更优选地，所述VHH02的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0017]与上述氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列所对应的纳米抗体，也即在对应的氨基酸序列或核苷酸序列的基础上将任意一个或多个位置的氨基酸或核苷酸替换为其他任意氨基酸或核苷酸之后得到的氨基酸序列或核苷酸序列，只要与本专利技术上述的氨基酸序列或核苷酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列均在本专利技术的保护范围内。
[0018]在某些实施方案中，所述纳米抗体还包括纳米抗体VHH01的功能性变异体、纳米抗体VHH02的功能性变异体，具体地，所述功能性变异体包括但不限于：在一级结构序列中基本类似、但包括本专利技术的亲本纳米抗体VHH01或VHH02中没有的，例如体外或体内的化学和/或生物化学改性的衍生物。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向BCMA的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括VHH01、VHH02；优选地，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示；更优选地，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示；最优选地，所述VHH01的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；最优选地，所述VHH01的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15所示；更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16所示；最优选地，所述VHH02的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；更优选地，所述VHH02的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。2.基于单纳米抗体的靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种；优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体还包含启动子；优选地，所述嵌合抗原受体还包含自断裂肽；优选地，所述嵌合抗原受体还包含检测标签/辅助功能元件；优选地，所述嵌合抗原受体还包含tEGFR信号肽；更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8α、CD28、4
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1BB、CD34、CD3ε、PD
‑
1、IgG1、IgG4、OX40、IL
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2受体、IL
‑
7受体、IL
‑
11受体；更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d；更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8α、CD28、CD34、4
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1BB、OX40、CD3ε、IgG1、IgG4、PD
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1、IL
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2受体、IL
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7受体、IL
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11受体；更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD16、CD22、CD33、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM
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CSF；更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4
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1BB(CD137)、CD19、CD4、CD27、CD28、ICOS(CD278)、CD8α、CD8β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM
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1、B7
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H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226；更优选地，所述启动子包括：EF1α启动子、CMV启动子、EFS启动子、CAG启动子、CBh启动子、SFFV启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子；
更优选地，所述自断裂肽包括：T2A、P2A、E2A、F2A；更优选地，所述检测标签/辅助功能元件包括：tEGFR、tCD34、tCD19、tCD20、tCD22、免疫检查点抑制剂(CTLA
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4、PD
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1/PD
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L1、LAG
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3、TIM
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3、TIGIT、CD226、CD155、CD47、B7
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H3、B7
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H4)纳米抗体、细胞因子及其受体(IL2、IL2受体、IL7、IL7受体、IL15、IL15受体)；最优选地，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；最优选地，所述共刺激信号结构域为4
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1BB共刺激信号结构域；最优选地，所述启动子为EF1α；最优选地，所述自断裂肽为T2A；最优选地，所述检测标签/辅助功能元件为tEGFR；最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4
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1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH01、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4
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1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4
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1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到。3.基于双纳米抗体的靶向BCMA的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种和其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体；优选地，所述其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体为VHH02；更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15所示；更优选地，所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16所示；最优选地，所述VHH02的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；最优选地，所述VHH02的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体还包含启动子；优选地，所述嵌合抗原受体还包含自断裂肽；优选地，所述嵌合抗原受体还包含检测标签/辅助功能元件；优选地，所述嵌合抗原受体还包含tEGFR信号肽；更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8α、CD28、4
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1BB、CD34、CD3ε、PD
‑
1、IgG1、IgG4、OX40、IL
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2受体、IL
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7受体、IL
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11受体；更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3
γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d；更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8α、CD28、CD34、4
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1BB、OX40、CD3ε、IgG1、IgG4、PD
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1、IL
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2受体、IL
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7受体、IL
‑
11受体；更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD16、CD22、CD33、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM
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CSF；更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4
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1BB(CD137)、CD19、CD4、CD27、CD28、ICOS(CD278)、CD8α、CD8β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM
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1、B7
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H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226；更优选地，所述启动子包括：EF1α启动子、CMV启动子、EFS启动子、CAG启动子、CBh启动子、SFFV启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子；更优选地，所述自断裂肽包括：T2A、P2A、E2A、F2A；更优选地，所述检测标签/辅助功能元件包括：tEGFR、tCD34、tCD19、tCD20、tCD22、免疫检查点抑制剂(CTLA
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4、PD
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1/PD
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L1、LAG
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3、TIM
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3、TIGIT、CD226、CD155、CD47、B7
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H3、B7
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H4)纳米抗体、细胞因子及其受体(IL2、IL2受体、IL7、IL7受体、IL15、IL15受体)；最优选地，所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；最优选地，所述共刺激信号结构域为4
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1BB共刺激信号结构域；最优选地，所述启动子为EF1α；最优选地，所述自断裂肽为T2A；最优选地，所述检测标签/辅助功能元件为tEGFR；最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种、Linker、其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4
‑
1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、其他任意一种靶向BCMA的纳米抗体、Linker、权利要求1所述的纳米抗体中的任意一种、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4
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1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH01、Linker、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4
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1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、VHH02、Linker、VHH02、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4
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1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；最优选地，所述Linker为(G4S)5。4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1所述的纳米抗体、权利要求2所述的嵌合抗原受体或权利要求3所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列；优选地，权利要求1所述的纳米抗体中的VHH01的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；
优选地，权利要求1所述的纳米抗体中的VHH02的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示；优选地，权利要求2所述的嵌...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建强，王琳，赵娜，
申请(专利权)人：河北森朗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：