一种利用荧光ARMS-PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种利用荧光ARMS

【技术实现步骤摘要】
一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物
，涉及一种荧光标记的ARMS
‑
PCR复合扩增体系。该体系共9个SNP位点，用于检测猫六项毛色，助力科学繁育猫稀有毛色。

技术介绍

[0002]宠主在挑选宠物猫时，毛色是很大的决定因素之一。根据市场流行度和繁育难度，不同毛色的品种猫售卖的价格也相差甚远。以近几年大火的英国短毛猫稀有色金渐层为例，紫金渐层作为大家追捧的稀有色，在市场上的售价比(黑)金渐层高出将近甚至不止10倍。
[0003]受到猫年龄和环境等诸多因素的影响，很多稀有色仅通过表型很难准确判断，这会造成在宠物交易中的(误)造假事件。此外，即使对很有繁育经验的人来说，在不清楚猫本身毛色的情况下，繁育难度也会大大增加。猫毛色基因检测可以帮助繁育者准确判断猫本身的毛色，并通过各基因的遗传概率指导精准繁育。
[0004]为了有效防止宠物猫交易中造假事件的发生，高效助力猫精准繁育，我们专利技术了包含决定猫常见毛色且需求较高的6大基因的多重体系，可以进一步降低猫毛色基因检测的成本。还以英国短毛猫稀有色渐层为例，纯色基因是决定渐层形成的基础，只有当纯色基因为A/A或A/a时，猫才能形成渐层；棕色基因和稀释基因共同决定了渐层的毛尖色，如当棕色基因为b/b，稀释基因为d/d时，渐层的毛尖色为紫色；麻纹基因决定英国短毛猫渐层是否有暗纹和三环，部分追求无纹无环的繁育者需要对该基因进行检测；当金渐层携带两份重点色基因时会形成金点，繁育点色的猫舍则需要对重点色基因进行检测；12色是英国短毛猫中的一个色号，是部分繁育者的繁育目标。英国短/长毛猫12色基因可以帮助判断渐层是否为12色及携带12色基因的情况。

技术实现思路

[0005]为实现以上目的，本专利技术提供了一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒，通过一管式扩增，可同时检测9个SNP位点。与现有技术相比，检测方法简单快捷、成本低，且准确度高。
[0006]本专利技术的另一个目的是提供一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色基因分型的方法。
[0007]为了实现本专利技术，我们采用如下技术方案：
[0008](1)ARMS引物设计
[0009]所述的引物采用Primer Premier5和NCBI Blast等软件设计而成，设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在(60
±
2)℃的范围内。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。
[0010](2)猫口腔拭子基因组DNA提取
[0011]采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
[0012](3)体系研究
[0013]选用猫口腔拭子提取的DNA及参考品作为模板，分别用上述9对引物进行单重扩增，通过毛细管电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到9对引物共同的扩增条件。通过多轮调整，综合体系均衡性、效率以及杂峰情况，体系在58℃时，扩增效果最佳，故选择58℃作为本试剂盒扩增的退火温度。
[0014](4)构建复合体系
[0015]将9对引物按照同等比例的引物量置于同一管中扩增，再根据复合扩增的毛细管电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致且同一个SNP位点检测结果无杂峰干扰，如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物，最终确定9对ARMS引物序列。
[0016](5)准确性研究
[0017]选取试剂盒扩增检测筛选出的突变样本，用金标准sanger测序法对样本进行扩增测序，与本试剂盒检测结果进行对比，对试剂盒的检测结果进行验证，确认试剂盒的准确性。
[0018](6)重复性验证
[0019]利用上述试剂盒对2ng/μL样本进行重复扩增测试，使用ABI 3730测序仪对扩增产物进行检测，测试该试剂盒的重复性。通过实验数据分析，3次重复中各个SNP位点的峰型均能清晰检测，且分型一致，故可判断该试剂盒具有良好的重复性。
[0020](7)适用机型研究
[0021]利用BIO
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RAD、ABI 9700PCR扩增仪对上述试剂盒进行扩增测试，利用ABI3730测序仪对产物进行检测。通过数据分析，BIO
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RAD的扩增效率高于ABI9700。表明相同条件下，体系在BIO
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RAD、ABI 9700PCR扩增仪上均能正常扩增，性能不受扩增仪器的影响，扩增产物在ABI 3730上均能清晰检测出，检测结果一致。
[0022](8)稳定性研究
[0023]将试剂盒
‑
20℃
±
5℃以下避光保存至冷冻；分别于第3天、第7天、第15天、第30天进行融化和冷冻。通过反复冻融对8个测试样本进行扩增检测，检测结果均一致，第30天冻融后检测结果无异常。
[0024](三)有益效果
[0025]本专利技术提供了一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒。具备以下有益效果：
[0026]本专利技术所述试剂盒通过对引物的优化，提高引物的特异性，使检测结果准确可靠；操作方法简单，检测时长短；一次性可以检测多个位点，成本低；灵敏度高，低至2ng/μL的DNA模板量可以得到准确分型。
附图说明
[0027]图1是本专利技术试剂盒3重复FAM通道
[0028]图2是本专利技术试剂盒3重复HEX通道
[0029]图3是本专利技术试剂盒ABI 9700与BIO
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RAD PCR扩增仪结果对比图。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]实施例1利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒扩增猫口腔拭子提取的基因组DNA样本
[0032](1)采集猫口腔拭子
[0033](2)DNA提取
[0034]采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
[0035](3)配置反应体系
[0036]将各反应试剂(2
×
Master Mix、引物混合液、无核酸酶纯水)震荡混合后按照体积比(模板除外)配置PCR反应混合液，分装9μL于PCR反应管中，最后往各反应管加入1μL模板，离心后进行下一步。反应体系组成见下表：
[0037]组分名称体积(μL)2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒，其特征在于：试剂盒包含9个SNP位点的引物，所述9个SNP位点分别为：棕色基因2个位点、稀释基因1个位点、麻纹基因2个位点、重点色基因2个位点、纯色基因1个位点、12色基因1个位点。2.根据权利要求1所述一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒，其特征在于：所述棕色基因2个位点为TYRP1:c.1262+5G>A(巧克力色)、TYRP1:c.298C>T(肉桂色)；所述稀释基因1个位点为MLPH:c.83delT，所述麻纹基因2个位点为DKK4:c.53C>T、DKK4:c.188G>A，所述重点色基因2个位点为TYR:c.679G>T、TYR:c.904G>A，所述纯色基因为ASIP:c.123_124delCA，所述12色基因为CORIN:c.2425C>T。3.根据权利要求1所述一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒，其特征在于：所述引物设计方法如下：设置野生型模板的ARMS引物，所述引物的3末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中在所述引物的3端第2
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4位设置一个错配碱基；设置突变型模板的ARMS引物，所述引物的3末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中在所述引物的3端第2
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4位设置一个错配碱基，在5末端增加4
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6个碱基区分片段长度。4.根据权利要求1所述一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒，其特征在于：共用一条上游荧光引物，所述荧光引物与所述针对野生型模板的ARMS引物和所述针对突变型模板的ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列，产生特定长度和荧光标记的扩增产物。扩增产物用毛细管电泳检测，通过片段大小、基因位点的产物峰高比值，确定样本的基因型。5.根据权利要求1所述一种利用荧光ARMS
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PCR毛细管电泳技术检测猫六项毛色试剂盒，其特征在于：所述引物及其序列如下：用于检测位点TYRP1:c.1262+5G>A的共用荧光下游引物序列为：SEQ1：GGGACATGTGGAAACAGCTAGAT，5'FAM修饰；用于检测位点TYRP1:c.1262+5G的特异性引物序列为：SEQ2：CTGAGGAGATATAATGCTGGTGTG；用于检测位点TYRP1:c.1262+5A的特异性引物序列为：SEQ3：GTTACTGAGGAGATATAATGCTGGTTAA；用于检测位点TYRP1:c.298C>T的共用荧光上游引物序列为：SEQ4：CAGTGACTGCAGACTCACGACC；5'FAM修饰；用于检测位点TYRP1:c.298C的特异性引物序列为：SEQ5：CTGAGAAATTGCCATTGCAACG；用于检测位点TYRP1:c.298T的特异性引物序列为：SEQ6：GTTCCTGAGAAATTGCCATTGCATGA；用于检测位点MLPH:c.83delT的共用荧光上游引物序列为：SEQ7：TGTCTTATTCCAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：郎丹丹，陈拼，李尚桐，
申请(专利权)人：北京格致博雅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：