一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，对猫CMAH基因上的4个单核苷酸突变位点进行检测。其特征在于：检测猫血型的单核苷酸突变位点包括：CMAH 179G>T，CMAH 268T>A，CMAH 364C>T，CMAH1322delT。本发明专利技术采用SNaPshot技术进行SNP分型检测，一次性可以检测多个位点，取样量少，且准确度高，结果容易判读。通过对猫血型检测，可有效避免新生儿溶血和输血不良反应。血和输血不良反应。血和输血不良反应。

【技术实现步骤摘要】
一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体为一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法。

技术介绍

[0002]我们的伴侣动物猫跟人一样，拥有自己的血型系统。猫公认的血型系统为AB型血型系统，包括3种血型：A型、B型和AB型。其中A型最常见，在不同的品种中，猫A血型高达90％。A型、B型和AB型的显隐性关系为：A型显性>AB型显性>B型显性。
[0003]宠物主人平时很少会想到检测猫的血型，除非自己的猫咪需要输血。和人一样，猫咪如果输错血型也很危险。在临床治疗中，当猫遇到外科手术、事故、贫血等需要输血的情况，如果没有输入相配的血，死亡的几率会很大。在繁育时，准确知道猫咪血型对繁育者意义重大，如果B型母猫与A型公猫交配，产下A型或AB型幼猫，当幼猫饮用母乳时则会造成红细胞破坏发生溶血，即新生儿溶血。这是因为B型母猫分娩后，乳汁中存在大量的A抗体，会攻击幼猫的红细胞，导致幼猫溶血症。据统计，新生猫溶血是造成新生幼猫死亡的最主要因素之一。因此，无论是临床还是繁育，提前了解猫咪的血型都十分重要。
[0004]目前常用的分型检测方法有Sanger测序、Taqman探针、Massarray等方法。Sanger测序一次仅能检测一个位点，费用高且耗时长；Taqman探针对探针的特异性要求高，不易设计；Massarray要求样本量多，准确度低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，包括以下步骤：
[0006]步骤一：根据SNaPshot分型技术，设计4个SNP位点引物，其包括扩增引物、延伸引物，并对扩增引物进行blast特异性比对；
[0007]步骤二：提取待测猫的口腔拭子基因组DNA；
[0008]步骤三：以待测猫的口腔拭子基因组DNA为模板，利用引物组合进行多重SNaPshot分型检测：包括多重PCR扩增；PCR产物纯化；多重延伸反应；延伸产物纯化；
[0009]步骤四：毛细管电泳，分析延伸产物，从而对猫血型进行判定。
[0010]优选的，所述步骤一中扩增名称为CMAH179
‑
F、CMAH 179
‑
R、CMAH268
‑
F、CMAH268
‑
R、CMAH364
‑
F、CMAH364
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R、CMAH1322
‑
F、CMAH1322
‑
R；延伸引物名称为CMAH179
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YS
‑
F、CMAH268
‑
YS
‑
F、CMAH364
‑
YS
‑
F、CMAH1322
‑
YS
‑
F。
[0011]优选的，所述步骤一中还包括以下步骤，
[0012]a：将扩增引物及延伸引物干粉12000rpm，离心2分钟；
[0013]b：按照引物合成说明书，用TE将干粉引物稀释至100μM；
[0014]c：再分别将扩增引物上下游稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重扩增引物；
[0015]d：将延伸引物稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重延伸引物。
[0016]优选的，所述步骤二中采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
[0017]优选的，所述步骤三中多重PCR扩增步骤如下，
[0018]a：预先将PCR扩增组分取出置冰上融化，10
×
buffer、dNTP、多重扩增引物混合液轻微震荡混匀，离心备用，Hstaq酶离心置于冰上备用；
[0019]b：配置PCR扩增混合液，每反应分装9μL；
[0020]c：加样，在9μL扩增反应体系中加入1μL DNA；
[0021]d：扩增，在PCR仪上进行PCR程序扩增，扩增程序如下：
[0022]95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、65℃～55℃每循环降低1℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行10个循环；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行25个循环；之后72℃延伸10分钟，4℃保存。
[0023]优选的，所述步骤三中PCR产物纯化步骤如下，
[0024]a：取4μL多重PCR产物；
[0025]b：加入2U SAP酶和2U Exonuc lease I酶；37℃温浴1小时；
[0026]c：然后75℃灭活20分钟。
[0027]优选的，所述步骤四中产物毛细管电泳检测步骤如下，
[0028]a：取1μL SAP处理完的延伸产物；
[0029]b：加入8.8μL HIDI及0.2μL Liz120，95℃变性3分钟；
[0030]c：立即冰浴2分钟，用测序仪进行测序。
[0031]优选的，所述测序完成后用genemapper6.0对分型结果进行判读，根据延伸引物大小设置panel、bin，依据出峰的位置及颜色判断每个位点的分型。
[0032](三)有益效果
[0033]本专利技术提供了一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法。具备以下有益效果：该一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，同现有其他技术相比，采用SNaPshot技术进行SNP分型检测，一次性可以检测多个位点，取样量少，且准确度高，结果容易判读。通过对猫血型进行检测，可有效避免新生儿溶血和输血不良反应。
附图说明
[0034]图1为实施例中对A型血样本进行SNaPshot分型检测结果；
[0035]图2为实施例中对A型血携带一份B型血样本进行SNaPshot分型检测结果；
[0036]图3—图6为图1样本sanger测序验证结果；
[0037]图7—图10为图2样本sanger测序验证结果；
[0038]图11为4个SNP位点检测分型结果对应的猫血型。
具体实施方式
[0039]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0040]实施例1
[0041]一、引物设计
[0042]根据SNaPshot分型检测技术，设计4个SNP位点引物，包含扩增引物及延伸引物。
[0043](一)、扩增引物
[0044][0045](二)、延伸引物
[0046][0047][0048]二、DNA提取
[0049]采用天根“高效口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”制备DNA。
[0050]三、稀释引物
[0051]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：根据SNaPshot分型技术，设计4个SNP位点引物，包括扩增引物、延伸引物，并对扩增引物进行blast特异性比对；步骤二：提取待测猫的口腔拭子基因组DNA；步骤三：以待测猫的口腔拭子基因组DNA为模板，利用引物组合进行多重SNaPshot分型检测：包括多重PCR扩增；PCR产物纯化；多重延伸反应；延伸产物纯化；步骤四：毛细管电泳，分析延伸产物，从而对猫血型进行判定。2.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤一中扩增名称为CMAH179
‑
F、CMAH179
‑
R、CMAH268
‑
F、CMAH268
‑
R、CMAH364
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F、CMAH364
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R、CMAH1322
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F、CMAH1322
‑
R；延伸引物名称为CMAH179
‑
YS
‑
F、CMAH268
‑
YS
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F、CMAH364
‑
YS
‑
F、CMAH1322
‑
YS
‑
F。3.根据权利要求1所述一种利用SNaPshot技术检测猫血型的方法，其特征在于：所述步骤一中还包括以下步骤，a：将扩增引物及延伸引物干粉12000rpm，离心2分钟；b：按照引物合成说明书，用TE将干粉引物稀释至100μM；c：再分别将扩增引物上下游稀释至10μM的工作液，按照1:1等比例混合多重扩增引物；d：将延伸引物稀释至10...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈拼，李尚桐，郎丹丹，
申请(专利权)人：北京格致博雅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：