一种快速、灵敏诊断基因编辑牡蛎的HRM分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于高分辨率熔解曲线(HRM)分析鉴别基因编辑牡蛎的方法，包括：提取G0代基因编辑牡蛎幼虫的gDNA，加入靶位点特异性引物和饱和性混合荧光染料，PCR扩增所提取的gDNA中包含编辑位点的DNA片段大小为100bp左右，从而获得靶位点附近序列的溶解温度，再利用软件中的模块进行分析。本发明专利技术首次提供了一种可快速检测基因编辑牡蛎的HRM检测方法，能够简化检测流程，实现高通量筛选，显著缩短检测所需时间，为基因编辑型牡蛎鉴别提供了快速、简便的方法。简便的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种快速、灵敏诊断基因编辑牡蛎的HRM分析方法


[0001]本专利技术涉及快速筛选基因编辑水产动物的研究
，更具体涉及一种基于高分辨率溶解曲线技术建立的基因编辑牡蛎的鉴别方法。

技术介绍

[0002]基因编辑是一种基因工程技术，可以在细胞和生物体基因组的特定位点进行修改、删除或插入一小段DNA序列。CRISPR(簇状规则间隔的短回文重复序列)/Cas9系统已经发展成为一种强大的基因编辑工具。随着这项技术的广泛应用，如何从基因编辑群体中快速、精准和高通量筛选设计的突变体显得尤为重要。迄今为止，已经有多种筛选技术，如聚合酶链式反应(PCR)/限制性内切酶(RE)法、T7内切酶I(T7EI)法、Surveyor核酸酶法、基于PAGE的基因分型法和基于退火的临界温度PCR(ACT
‑
PCR)分析法。但以上检测方法都存在耗时费力且需要靶位点序列特异性等局限性。
[0003]高分辨率熔解曲线(high
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resolutionmelting，HRM)分析是在荧光定量PCR的基础上发展起来的突变筛查和分型技术，被广泛应用于未知基因突变筛选、SNP分型、甲基化等研究。该技术的原理主要为由于DNA序列的片段大小、GC含量和分布以及碱基互补性差异等的不同，会造成双链DNA分子解链时Tm值的不同。再利用荧光染料可以插入双链DNA的特性和可精确控制温度的实时荧光定量PCR仪，监测温度变化过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况生成高分辨率熔解曲线，就可以检测基因编辑后导致的单碱基变异、小插入或缺失等。并且，这是一种简单的闭管且无损的实验，因此后续可以将HRM分析后的产物直接通过克隆测序、凝胶电泳等下游分析的方法进行熔后DNA样品回收。
[0004]牡蛎是我国具有非常重要经济价值的贝类，且具有世界性分布的特点。近年来，各国相继开展了牡蛎遗传育种，然而目前的育种工作还主要基于传统的人工选育方法，分子育种技术还并未得到实际应用。近年来，随着海洋贝类基因编辑技术的发展，牡蛎已经初步实现通过显微注射技术或电转技术对受精卵进行基因编辑系统的导入。然而，检测牡蛎基因编辑效率的方式主要通过大量直接测序进行筛选，这种方法仍然存在耗时、昂贵且流程繁琐等缺点。
[0005]本专利技术将HRM技术应用于筛选基因编辑牡蛎，相较于其他的检测手段，HRM分析可以在96孔的PCR板上进行高通量筛选，且不受突变类型和突变位点的限制，操作简单灵活，具有灵敏度高、特异性强和成本低廉等优点。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种快速、灵敏筛选基因编辑牡蛎的方法。
[0007]为实现上述目的，本方法公开如下的
技术实现思路
：一种基于HRM的分析方法，利用从单个G0代牡蛎幼虫中提取的gDNA，高通量、快速且灵敏地筛选出基因编辑导致基因型突变的牡蛎个体。
[0008]进一步的，单个牡蛎幼虫gDNA的提取用chelex
‑
100树脂和蛋白酶K，并在55℃下孵
育2h，99℃灭活10min后，用移液枪吸取上清液。
[0009]进一步的，单个牡蛎幼虫为受精卵在22℃的海水中孵育24h的D型幼虫。
[0010]进一步的，HRM分析以提取的牡蛎幼虫gDNA为模板，在靶位点附近设计扩增子小于200bp的特异性引物。
[0011]进一步的，特异性引物的扩增范围避开SNP突变位点，且大小在100bp左右。
[0012]进一步的，为了更加稳定地收集荧光信号，将荧光剂和扩增酶混合，加入混合饱和性荧光染料。
[0013]进一步的，高通量且快速的一次性HRM分析可利用96孔板或384孔板上机，且HRM分析后的样品可应用于后续的克隆、测序等突变类型分析。
[0014]进一步的，HRM筛选G0代基因编辑牡蛎的灵敏度为10％(一个样品中突变牡蛎幼虫gDNA浓度/所测样品gDNA的总浓度为10％)。
[0015]本专利技术的优点和有益效果：1、本专利技术的筛选方法中，HRM检测不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR之后可直接用HRM检测，即可完成对样品突变的分析，省去了琼脂糖电泳等步骤，该方法具有操作简便快熟的优点。
[0016]2、本专利技术的筛选方法中，HRM引物易于高通量操作。PCR扩增产物可以在仪器上如LightCycler 480上，一次可以同时96个或384个样品直接分型，完成对突变体牡蛎的鉴定，因此较其他方法更加适用于高通量分析。
[0017]3、本专利技术的筛选方法中，该方法比克隆测序和T7E1酶检测都要节约成本，该方法具有成本低廉的优势。
[0018]4、利用本专利技术的方法辅助育种，方便、准确，节约成本，可以有效提高基因编辑牡蛎筛选效率。
附图说明
[0019]图1为实施例中，对长牡蛎TYR
‑
2基因编辑的突变检测归一化高分辨率曲线。
[0020]图2为实施例中，对长牡蛎TYR基因编辑的突变检测归一化高分辨率曲线。
[0021]图3为实施例中，对HRM分析后的所有样品序列分析对比图。
具体实施方式
[0022]本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0023]以长牡蛎TYR
‑
2和TYR基因为例，建立了筛选基因编辑牡蛎的HRM方法，下面做进一步详细阐述。
[0024]1)长牡蛎基因突变幼虫gDNA和未编辑牡蛎幼虫gDNA的获得分别针对长牡蛎靶基因TYR
‑
2(GeneID：105344040)和TYR(GeneID：105329903)的第五个外显子和第二个外显子为靶位点，通过显微注射方法获取基因编辑的长牡蛎D型幼虫(受精卵孵育24h)，再利用chelex
‑
100树脂和蛋白酶K，并在55℃下孵育2h，99℃灭活10min提取牡蛎幼虫的gDNA。
[0025]2)特异性引物的选择
分别针对TYR
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2和TYR的靶位点，设计了四条单链oligo特异性序列DNA，扩增片段大小在100bp左右，其核苷酸序列如下所示：TYR
‑
2F1:TGTTATCATTTGATCCCTCCTATTTATYR
‑
2R1：CTGACTGGACCCTTTGGAAGATTYR
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F2：GAAACTTTGCCGCCAAAAACGTYR
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R2：GAAACTTTGCCGCCAAAAACG3)PCR反应按照上述的特异性引物对供试样品模板DNA进行PCR扩增(仪器为Roche480)，其中PCR的总体积为20μl，扩增反应体系为：Primer F(2.5μM)1.4μlPrimer R(2.5μM)1.4μlDNA(至少5ng/μl)2μlfluorescent dyes(EvaGreen mix，ABI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于HRM的分析方法，利用从单个G0代牡蛎幼虫中提取的gDNA，高通量、快速且灵敏地筛选出基因编辑导致G0代牡蛎基因型突变的个体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单个牡蛎幼虫gDNA的提取用chelex
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100树脂和蛋白酶K，并在55℃下孵育2h，99℃灭活10min后，用移液枪吸取上清液。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述单个牡蛎幼虫为受精卵在22℃海水中孵育24h的D型幼虫。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HRM分析以提取的牡蛎幼虫gDNA为模板，在靶位点附近设计扩增子小于200bp的特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琪，李倩，于红，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：