一种炭疽菌CsATLP基因及应用制造技术

本发明专利技术提供一种炭疽菌CsATLP基因及应用，基因无内含子，含有一个Bys1结构域。实验证实了该基因缺失可降低真菌对咯菌腈等吡咯类药剂抗性，说明CsATLP基因可应用于调控真菌对吡咯类药剂的抗性，CsATLP基因可以作为吡咯类药物靶标。物靶标。物靶标。

【技术实现步骤摘要】
一种炭疽菌CsATLP基因及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种炭疽菌CsATLP基因及应用。

技术介绍

[0002]靶标蛋白的分离和鉴定是靶向药物分子设计合成和创制开发的重要基础。吡咯类杀菌剂，包括咯菌腈和拌种咯(fenpiclonil)是1984年瑞士Ciba
‑
Geigy(现在的先正达公司)研究专利技术的新型吡咯类非内吸性杀菌剂。它是假单细胞菌所产生的次生代谢产物硝吡咯菌素的类似物，它比硝吡咯菌素抗光解能力强，具有专一性，对其他杀菌剂无干扰性，能够抑制大多数细菌孢子发芽、菌体生长、杀灭细菌或真菌的功效，现已广泛的应用在植物采前和采后病害防治上，尤其是在种子处理剂。目前，关于吡咯类杀菌剂的靶标基因或蛋白的研究仍然鲜有报道。对于咯菌腈的作用靶标仍未知。

技术实现思路

[0003]本研究组在开展炭疽菌HOG MAPK途径如何参与调控菌体对咯菌腈等药剂敏感性的研究时，利用酵母双杂交技术对HOG MAPK途径关键成员Pbs2和Hog1的互作蛋白进行筛选，发现一个抗原性类甜蛋白(Antigenic thaumatin
‑
like protein)，既是Pbs2又是Hog1的互作蛋白，但该基因目前未见任何相关功能的报道。而本研究组通过基因功能分析，证实了CsATLP蛋白参与炭疽菌对咯菌腈药剂敏感性的调控功能，可以作为吡咯类药物靶标。
[0004]本专利技术方案包括以下主要内容：
[0005]一种炭疽菌CsATLP基因，所述基因含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0006]一种CsATLP基因敲除突变体，包括以下制备步骤：第一轮PCR，在CsATLP基因编码阅读框架前后，设计引物对CsATLP
‑
UF/CsATLP
‑
UR和CsATLP
‑
DF/CsATLP
‑
DR，利用PCR扩增获得CsATLP基因上臂序列和C端后的下臂序列，CsATLP
‑
UR和CsATLP
‑
DF分别含有氯嘧磺隆抗性基因接头序列，设计引物对S1F/S2R扩增得到氯嘧磺隆抗性基因ILV1；
[0007]第二轮PCR，将第一轮PCR扩增得到的产物利用引物CsATLP
‑
UF/CsATLP
‑
DR进行融合；
[0008]第三轮PCR，将第二轮PCR融合的产物利用引物CsATLP
‑
UF/CsATLP
‑
DR进行富集；将富集的片段导入橡胶树炭疽菌原生质体中，通过含氯嘧磺隆的培养基进行筛选，然后PCR验证，即得；
[0009]所述CsATLP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0010]引物CsATLP
‑
UF的序列为：5
’‑
GCAGATCTGACCCATCTTGTC
‑3’
[0011]引物CsATLP
‑
UR的序列为：
[0012]5’‑
AGATGTGGGGCACTGTGGCGTTGGCACTTTTTGGTTTTGTGTG
‑3’
[0013]引物CsATLP
‑
DF的序列为：
[0014]5’‑
TATTGCACGGGAATTGCATGCTCTCACGTGATGAACATCTTGG
‑3’
[0015]引物CsATLP
‑
DR的序列为：5
’‑
ACATTTGCCGCCGCACA
‑3’
[0016]引物S1F的序列为：5
’‑
GTGCCAACGCCACAGTGCCCCACA
‑3’
[0017]引物S2R的序列为：5
’‑
GTGAGAGCATGCAATTCCCGTGCAATA
‑3’
。
[0018]本专利技术还涉及所述的炭疽菌CsATLP、所述的CsATLP基因敲除突变体中的至少一种在调控真菌对吡咯类药剂敏感性方面的应用。
[0019]进一步的，本专利技术涉及所述的CsATLP基因在作为吡咯类药剂作用靶点方面的应用。
[0020]进一步的，本专利技术涉及所述的CsATLP基因敲除突变体在降低真菌对吡咯类药剂敏感性方面的应用。
[0021]进一步的，所述吡咯类药剂为咯菌腈。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术克隆了CsATLP基因，构建了CsATLP基因敲除突变体，经过功能性实验证实了该基因参与调控真菌对咯菌腈等吡咯类药剂的敏感性，该基因的缺失能够降低炭疽菌对咯菌腈等吡咯类药剂的抗性。因此，CsATLP基因或其编码的蛋白可以作为药物靶标，以CsATLP基因作为靶点可以筛选到降低真菌致病力的药物，这些药物都可作为抑制真菌生长的杀菌剂。因此，CsATLP基因在防治植物真菌病害方面具有良好的应用空间和前景。
附图说明
[0024]图1：CsATLP基因敲除示意图。
[0025]图2：基因缺失突变体
△
CsATLP的PCR验证结果图。
[0026]图3：野生型HN08菌株、突变体
△
CsATLP菌株在不同咯菌腈浓度的CM培养基的菌落生长形态(5d)。
具体实施方式
[0027]为了便于技术人员理解本专利技术
技术实现思路
，下面结合具体实施例和附图对本专利技术做进一步的详细说明。
[0028]实施例1橡胶树炭疽菌CsATLP基因的克隆
[0029]根据前期酵母双杂技术获得的序列片段，利用BLAST技术，在NCBI中搜索获得的暹罗炭疽菌(C.siamense)抗原性类甜蛋白CsATLP的基因全长序列，设计引物对CsATLP
‑
F(5
’‑
ATGCAGCTCCCTTCCCTCCT
‑3’
)/CsATLP
‑
R(5
’‑
AGCCGCACACAGCGTCAA
‑3’
)，以橡胶树炭疽菌C.siamense HN08的cDNA和DNA为模板，分别扩增获得目的条带。序列分析显示：所得到的序列包含完整的编码开放阅读框。DNA序列大小为462bp，cDNA序列大小为462bp，该基因不含内含子，含有一个Bys1结构域。在NCBI中比对显示，该基因编码蛋白为抗原性类甜蛋白(Antigenic thaumatin
‑
like protein)，我们将该基因命名为CsATLP。
[0030]实施例2CsATLP基因基因敲除突变体的获得
[0031]基于同源重组技术结合炭疽菌的生物学特性，在炭疽菌基因组数据库获得上下游片段序列。
[0032]第一轮PCR，在CsATLP基因编码阅读框架前后，设计引物对CsATLP
‑
U本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种炭疽菌CsATLP基因，其特征在于，所述基因含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。2.一种CsATLP基因敲除突变体，其特征在于，包括以下制备步骤：第一轮PCR，在CsATLP基因编码阅读框架前后，设计引物对CsATLP
‑
UF/CsATLP
‑
UR和CsATLP
‑
DF/CsATLP
‑
DR，利用PCR扩增获得CsATLP基因上臂序列和C端后的下臂序列，CsATLP
‑
UR和CsATLP
‑
DF分别含有氯嘧磺隆抗性基因接头序列，设计引物对S1F/S2R扩增得到氯嘧磺隆抗性基因ILV1；第二轮PCR，将第一轮PCR扩增得到的产物利用引物CsATLP
‑
UF/CsATLP
‑
DR进行融合；第三轮PCR，将第二轮PCR融合的产物利用引物CsATLP
‑
UF/CsATLP
‑
DR进行富集；将富集的片段导入橡胶树炭疽菌原生质体中，通过含氯嘧磺隆的培养基进行筛选，然后PCR验证，即得；所述CsATLP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；引物CsATLP
‑
UF的序列为：5
’‑
GCAGATCTGACCCATCTTGTC
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：林春花，鲁婧文，郗奕滔，缪卫国，张宇，刘文波，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：