一种抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体提供了一种抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，该方法包括细胞澄清、亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析。本发明专利技术提供了专门适用于抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体能够有效抑制LILRB4抗原与其配体复合物的结合，从而阻断其与配体ApoE复合物的相互作用，进而阻止下游NF

【技术实现步骤摘要】
一种抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法。

技术介绍

[0002]急性髓系白血病(AML)是成人中最常见的急性白血病，其特征是骨髓中异常成髓细胞(一种白细胞)的增殖，其临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等，多数病例病情急重，预后凶险，如不及时治疗常可危及生命。作为一种常见的血液恶性肿瘤，AML占全部急性白血病的70％左右，是国内十大高发恶性肿瘤之一。尽管在治疗方面取得了进展，但是在首次确诊后的五年内，AML患者中只有不到30％的人还活着，CMML是一种始于骨髓中造血细胞并侵入血液的癌症。这种情况很罕见，美国每年大约有1100例。
[0003]白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B蛋白(LILRBs)是一组I型跨膜糖蛋白，由于其免疫抑制功能，LILRBs被认为是髓系细胞的免疫检查点蛋白。LILRB4主要是改变了免疫抑制的微环境，从而抑制了T细胞活性，导致免疫逃逸这种情况的发生，并出现肿瘤细胞的增殖转移等不良后果。通过体外细胞实验以及人源化的小鼠模型实验，研究者发现LILRB4表达呈阳性的单核急性髓系白血病细胞能显著抑制T细胞增殖。因此开发针对LILRB4的抗体，可以有效缓解T细胞抑制，从而有效杀伤肿瘤细胞。
[0004]目前，针对抗LILRB4单克隆抗体在工艺研发过程中，往往会遇到很多问题，降解物和目的蛋白理化性质难以分离，工艺过程样品不稳定，这对于工艺的纯化要求高。经典的抗体药物制备工艺主要包括抗体的捕获和精细纯化两个阶段，一般采用三步层析法。细胞培养上清经亲和层析捕获后，收集样品成分仍较复杂，含聚体、降解产物、宿主DNA和宿主细胞蛋白等多种杂质，一般还需经阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析进一步去除，才能获得质量符合要求的产品。但是每一步层析结束后均需通过换液或者调整缓冲液来适应下一步的纯化条件，过多的中间操作步骤不仅造成时间的浪费，还会影响收率、增加成本，而且可能面临引入新杂质的风险。因此，急需开发一种能够专门适用于本专利技术提供的抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法。

技术实现思路

[0005]为了解决现有纯化方法中存在的上述问题，本专利技术公开了一种抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法。
[0006]本专利技术具体技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，该方法包括：
[0008]S1、细胞澄清：采用离心或深层过滤的方式对含有抗LILRB4单克隆抗体的细胞液进行澄清；
[0009]S2、亲和层析：利用亲和层析柱对所述细胞液进行初步纯化和浓缩，收集蛋白溶液，并将所述蛋白溶液在酸溶液中进行病毒灭活；
[0010]S3、阳离子交换层析：通过阳离子交换层析柱对所述蛋白溶液进行精纯，并收集洗
脱液；
[0011]S4、阴离子交换层析；使用阴离子交换层析柱对步骤S3中的所述洗脱液进行提纯，并收集纯化后的所述蛋白溶液；
[0012]所述抗LILRB4单克隆抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的重链互补决定区HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的重链互补决定区HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No:3所示的重链互补决定区HCDR3、氨基酸序列如SEQ IDNo:4所示的轻链互补决定区LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:5所示的轻链互补决定区LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No:6所示的轻链互补决定区LCDR3。
[0013]本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供了专门适用于抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，首先筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体能够有效抑制LILRB4抗原与其配体复合物的结合，从而阻断其与配体ApoE复合物的相互作用，进而阻止下游NF
‑
κB信号通路的激活和ARG1的释放，防止T细胞增殖的抑制，及组织浸润的促进；此外，本专利技术筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体能够用于治疗癌症，癌症包括但不限于急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、母细胞性浆细胞样树状突细胞肿瘤(BPDCN)、乳腺癌、肺癌或前列腺癌；其次，本专利技术通过大量实验筛选了三步纯化法所需的条件和层析填料，有效提高抗LILRB4单克隆抗体的纯化效率和回收率，同时本专利技术中阳离子交换层析的洗脱条件与阴离子交换层析的流穿条件基本一致，所以阳离子交换层析收集的样品，只需微调pH和电导值，可直接进入阴离子交换层析，中间无需进行样品处理或超滤换液，不仅大大的节约了纯化时间，而且避免了纯化过程中引入杂质，提高了纯化蛋白的纯度，具有较高的实用性。
附图说明
[0014]图1为本专利技术实施例2中pScFv
‑
Disb
‑
HS载体的质粒图谱；
[0015]图2为本专利技术实施例3中梯度稀释ELISA抗LILRB4噬菌体单克隆抗体相对亲和力的比较图；
[0016]图3为本专利技术实施例5中载体pTSE的图谱；
[0017]图4为本专利技术实施例5中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0018]图5为本专利技术实施例6中鼠源抗体与LILRB4的结合能力比较图；
[0019]图6为本专利技术实施例8中鼠源抗体与人单核细胞白血病细胞(THP
‑
1)表面LILRB4的结合能力比较图；
[0020]图7本专利技术实施例9中鼠源抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验比较图；
[0021]图8为本专利技术实施例10中鼠源抗体抑制THP
‑
1分泌ARG1实验比较图；
[0022]图9为本专利技术实施例12中嵌合抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0023]图10为本专利技术实施例15中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0024]图11为本专利技术实施例16中人源化抗体与LILRB4结合实验图；
[0025]图12为本专利技术实施例17中人源化抗体与THP
‑
1细胞表面LILRB4的结合实验比较图；
[0026]图13为本专利技术实施例18中人源化抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验比较图；
[0027]图14为本专利技术实施例19中人源化抗体抑制THP
‑
1分泌ARG1实验比较图；
[0028]图15为本专利技术实施例20中人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)实验比较图。
具体实施方式
[0029]下面结合以下实施例对本专利技术作进一步详细说明。
[0030]实施例1
[0031]本专利技术公开了一种抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，该方法包括：
[0032]S1、细胞澄清：采用离心或深层过滤的方式对含有抗LILRB4单克隆抗体的细胞液进行澄清；
[0033]S2、亲和层析：利用亲和层析柱对细胞液进行初步纯化和浓缩，收集蛋白溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，该方法包括：S1、细胞澄清：采用离心或深层过滤的方式对含有抗LILRB4单克隆抗体的细胞液进行澄清；S2、亲和层析：利用亲和层析柱对所述细胞液进行初步纯化和浓缩，收集蛋白溶液，并将所述蛋白溶液在酸溶液中进行病毒灭活；S3、阳离子交换层析：通过阳离子交换层析柱对所述蛋白溶液进行精纯，并收集洗脱液；S4、阴离子交换层析：使用阴离子交换层析柱对步骤S3中的所述洗脱液进行提纯，并收集纯化后的所述蛋白溶液；所述抗LILRB4单克隆抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的重链互补决定区HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的重链互补决定区HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No:3所示的重链互补决定区HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的轻链互补决定区LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:5所示的轻链互补决定区LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No:6所示的轻链互补决定区LCDR3。2.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗LILRB4单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子包括氨基酸序列如SEQ ID No:7所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:8所示的轻链可变区。3.如权利要求2所述的抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种，所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:15所示的鼠源C
k
型的恒定区；所述IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，所述IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示，所述IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，所述IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示。4.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗LILRB4单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：HA
‑Ⅰ
：氨基酸序列如SEQ ID No:20所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:21所示的轻链可变区；HA
‑Ⅱ
：氨基酸序列如SEQ ID No:22所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:23所示的轻链可变区；HA
‑Ⅲ
：氨基酸序列如SEQ ID No:24所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID No:25所示的轻链可变区。5.如权利要求4所述的抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，所述人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:19所示的人C
k
型的恒定区；所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。6.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，亲和层析：利用亲和层析柱对所述细胞液进行初步纯化和浓缩，收集蛋白溶液，并将所述蛋白溶
液在酸溶液中进行病毒灭活，具体包括以下方法：S201、使用浓度为30
‑
60mM的缓冲液B1对所述亲和层析柱进行平衡，所述亲和层析柱的填料选自MabSelect Sure LX、MabSelect PrismA、Eshmuno A或NMab Pro；所述缓冲液B1选自Tris
‑
HCl缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B1的pH为7
‑
8，所述缓冲液B1的电导率为10
‑
30mS/cm；S202、将含有抗LILRB4单克隆抗体的细胞液以50
‑
300cm/h的流速上...

【专利技术属性】
技术研发人员：白义，刘晓航，
申请(专利权)人：北京东方百泰生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：