【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，特别涉及一种抗siglec-15单克隆抗体的纯化方法。
技术介绍
1、目前，我国恶性肿瘤发病、死亡数持续上升，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿。在过去的10余年里，恶性肿瘤生存率呈现逐渐上升趋势，目前我国恶性肿瘤的5年相对生存率约为40.5％，与10年前相比，我国恶性肿瘤生存率总体提高约10个百分点，但是与发达国家还有很大差距，为此，癌症药物的研发迫在眉睫。随着生物技术药物发展的日新月异，生物技术药物已经成为了全球炙手可热的新药研发领域。
2、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15(sialic acid-binding ig-like lectin15，siglec-15)，是siglec基因家族的一员，也是一种dap12相关免疫受体，属于免疫球蛋白超家族和唾液酸结合ig样凝集素家族。siglec-15由免疫球蛋白(ig)样结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成。siglec-15分为外源性和内源性两种。通常，外源性siglec-15高表达于肿瘤细胞表面，内源性siglec-15主要表达在巨噬细胞及树突状细胞表面，而在人和小鼠组织以及各种细胞类型中最低限度表达。研究发现，siglec-15具有抑制t细胞活性的功能，巨噬细胞表达的siglec-15可直接抑制人和小鼠t细胞的增殖和活性，并抑制ifnγ和tnfα的分泌；小鼠体内对siglec-15的基因敲除和抗体封闭，均可以增强微环境中的肿瘤免疫，抑制某些小鼠模型中的肿瘤生长。因此，siglec15是一个全新的广泛存在于多种肿瘤中的免疫抑制分子，具
3、经典的抗体药物制备工艺主要包括抗体的捕获和精细纯化两个阶段，一般采用三步层析法。细胞培养上清经亲和层析捕获后，收集样品成分仍较复杂，含聚体、降解产物、宿主dna和宿主细胞蛋白等多种杂质，一般还需经阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析进一步去除，才能获得质量符合要求的产品。每一步层析结束后需要过滤或调整样品来适应下一步的纯化条件，例如在低ph病毒灭活结束后，采用微孔过滤或者深层过滤的方法澄清样品，接着运用阴离子交换层析流穿模式进一步的去除杂质或者病毒。过多的中间操作步骤不仅造成时间的浪费，还会影响收率、增加成本，而且可能面临引入新杂质的风险。因此，急需开发一种能够专门适用于本专利技术提供的抗siglec-15单克隆抗体的纯化方法。
技术实现思路
1、为了解决现有技术公开的纯化工艺中存在的工艺复杂，影响纯化回收率，增加成本，且可能面临引入新杂质的风险等问题，本专利技术专门提供了一种适用于抗siglec-15单克隆抗体的纯化方法。
2、本专利技术具体技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种抗siglec-15单克隆抗体的纯化方法，所述方法包括以下步骤：
4、s1、亲和层析：利用亲和层析柱对含有抗siglec-15单克隆抗体的细胞液进行初步纯化和浓缩，收集蛋白溶液，并将所述蛋白溶液在酸溶液中进行病毒灭活；
5、s2、深层过滤膜包过滤：将所述蛋白溶液的ph值调节至5-7，电导率调节至3-5ms/cm，并通过所述深层过滤膜包进行过滤；
6、s3、阳离子交换层析：利用阳离子交换层析柱对过滤后的所述抗体蛋白溶液进行精纯，得到精纯的所述抗siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液。
7、本专利技术根据抗siglec-15单克隆抗体的特性筛选出适合该抗体的纯化工艺，其中，步骤s1中亲和层析用于捕获目的抗体蛋白，步骤s2中选择深层过滤膜包过滤能够实现抗体工艺中低ph病毒灭活样品的澄清，同时可以达到对可溶性和不溶性杂质进行更精准的分离，步骤s3中阳离子交换层析用于精细纯化抗体蛋白，通过上述方法能够提升抗体的生产效率，不仅大大的节约了纯化时间，而且避免了纯化过程中引入杂质，提高了蛋白的纯度，具有较高的实用性。
8、进一步的，所述抗siglec-15单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用hcdr1、hcdr2和hcdr3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用lcdr1、lcdr2和lcdr3表示的轻链互补决定区，所述重链互补决定区hcdr1的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述重链互补决定区hcdr2的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述重链互补决定区hcdr3的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述轻链互补决定区lcdr1的氨基酸序列如seq id no:4所示，所述轻链互补决定区lcdr2的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述轻链互补决定区lcdr3的氨基酸序列如seq id no:6所示。
9、本专利技术通过对免疫文库的筛选，得到了可以与siglec-15特异性结合且具有较高生物学活性的抗siglec-15单克隆抗体。
10、进一步的，所述抗siglec-15单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子的所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq idno:8所示；
11、所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no:15所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如seq id no:16所示。
12、进一步的，所述抗siglec-15单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
13、ha-ⅰ：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:24所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:25所示；
14、ha-ⅱ：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:24所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:26所示。
15、进一步的，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no:23所示；所述人源化抗体重链恒定区的氨基酸序列如seq id no:20所示。
16、进一步的，步骤s1中，所述亲和层析具体包括以下步骤：
17、s101、使用浓度为30-60mm的缓冲液b1对所述亲和层析柱进行平衡，所述亲和层析柱的填料选自mabselect sure lx、mabselect prisma、eshmuno a或nmab pro；所述缓冲液b1选自tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液b1的ph为7-8，所述缓冲液b1的电导率为10-30ms/cm；
18、s102、将含有抗siglec-15单克隆抗体的细胞液以50-300cm/h的流速上样至所述亲和层析柱上，上样载量为20-55mg蛋白/ml填料，所述亲和层析柱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗Siglec-15单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQID No:4所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
3.如权利要求2所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗Siglec-15单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子的所述重链可变区的氨
4.如权利要求2所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗Siglec-15单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
5.如权利要求4所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示；所述人源化抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQID No:20所示。
6.如权利要求1所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析具体包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析柱的填料为NMab Pro，所述缓冲液B1为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.0-7.6，所述Tris-HCl缓冲液的电导率为18mS/cm；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，且所述Tris-HCl缓冲液中含有120-160mM的添加剂，所述添加剂为NaCl；
8.如权利要求1所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述深层过滤膜包选自Natrix Q膜、Mustang Q膜或Polisher ST膜；
9.如权利要求1所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述阳离子交换层析，具体包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱的填料为NanoGel 50SP；
...【技术特征摘要】
1.一种抗siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的抗siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗siglec-15单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用hcdr1、hcdr2和hcdr3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用lcdr1、lcdr2和lcdr3表示的轻链互补决定区，所述重链互补决定区hcdr1的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述重链互补决定区hcdr2的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述重链互补决定区hcdr3的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述轻链互补决定区lcdr1的氨基酸序列如seqid no:4所示，所述轻链互补决定区lcdr2的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述轻链互补决定区lcdr3的氨基酸序列如seq id no:6所示。
3.如权利要求2所述的抗siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗siglec-15单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子的所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示；
4.如权利要求2所述的抗siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗siglec-15单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
【专利技术属性】
技术研发人员：白义，刘晓航，肖超，
申请(专利权)人：北京东方百泰生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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