一种鉴别防风与水防风的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别防风与水防风的检测方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备；(2)样品分析，分别采集供试品溶液的总离子流图；(3)PCA分析和聚类分析；(4)差异性标志物的筛选：使用MPP数据处理软件的查找特征化合物功能，将防风和水防风分为两组，根据化合物响应值筛选组间的差异化合物，通过解析各差异化合物的提取离子流图，获得峰形好、响应值高、保留时间适中且防风中不存在的差异性标志物；(5)差异性标志物的分离纯化与化学结构鉴定；(6)对照品溶液的制备；(7)待测样品溶液的制备；(8)检测与判定。本发明专利技术从化学成分角度建立防风与水防风辨识的新方法，该方法灵敏、准确、可靠，可用于防风的质量控制。可用于防风的质量控制。可用于防风的质量控制。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别防风与水防风的检测方法


[0001]本专利技术涉及防风鉴别
，特别是涉及一种鉴别防风与水防风的检测方法。

技术介绍

[0002]防风为伞形科植物防风的干燥根，性味辛、甘，微温，具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功效。主要用于感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风的治疗。防风药用历史悠久，《神农本草经》将其列为上品，《古代经典名方目录(第一批)》中，汉方“桂枝芍药知母汤”、唐方“小续命汤”和宋方“辛夷散”等10首名方均有使用防风。研究发现，防风的药理活性成分主要分为香豆素、色原酮、多糖和挥发油四类。
[0003]防风为大宗药材，流通量大，产地繁多。野生品主要分为关防风、口防风和西北防风，以内蒙古、黑龙江、甘肃等省份为主产区。栽培品因河北地区栽培早且量大，又被称为冀防风，以河北、山西、陕西等省份为主产区。随着市场需求逐年增大，野生防风资源日渐匾乏，交易价格居高不下。调研发现，市场中存在水防风、川防风和云防风等混淆品冒充防风的现象，其中又以水防风较多。水防风为宽萼岩风的干燥根，解表功效略逊于防风，但毒性较防风强，临床应慎用。
[0004]目前，防风法定检验标准为2020年版《中国药典》，对样品的6方面理化指标做出限度值规定，包括性状、显微、薄层鉴别、水分、总灰酸灰、升麻素苷和5
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甲基维斯阿米醇苷的含量。水防风检验标准为1991年版《河南中药材标准》，仅检测性状和显微，质量品质难以控制。按防风的标准进行水防风的检验，结果水防风的外观性状、显微特征、含量控制指标均符合标准要求，两者之间的差异性极不明显，现行标准难以用于区分防风的真伪，容易出错。
[0005]查阅国内外文献，发现至今仅有《基于HPLC指纹图谱的防风与其伪品水防风的鉴别研究》和《基于高效液相指纹图谱和化学计量法的防风药材及其伪品的鉴别》2篇文献，以液相色谱法对防风所含化合物进行了简单分析，且都存在两方面缺陷：一方面，液相色谱是基于特定紫外波长采集化合物的信息，改变紫外波长会出现完全不同的指纹图谱；另一方面，文献均未明确特定化合物成分，用于快速筛选区分真伪防风，指纹图谱的分析存在耗费时间长，标准指纹图谱建立、获取困难等问题，难以作为法定质量标准应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种鉴别防风与水防风的检测方法，从化学成分角度建立防风与水防风辨识的新方法，该方法灵敏、准确、可靠，可用于防风的质量控制。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种鉴别防风与水防风的检测方法，包括以下步骤：
[0009](1)供试品溶液的制备：分别取等量的多批确切来源的防风和水防风样品粉末，各样品粉末中分别加入甲醇，称定重量，超声处理后放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减
Poroshell120EC
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的色谱柱，流动相：乙腈
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0.1％甲酸溶液，柱温30℃，流速0.5mL
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min
‑1；
[0022]质谱条件为电喷雾离子化源，采集模式为正离子模式，干燥气温度为300℃，干燥气流速为5L/min，雾化器压力为35psi，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11L/min，毛细管电压为3500V，喷嘴电压为500V，质量扫描范围为50～1000m/z，碎裂电压为135V。
[0023]PCA分析的具体方法为：将质谱原始数据导入MPP数据处理软件，使用峰匹配、峰对齐、噪声过滤的筛选方法，提取特征峰的数据；再以p值小于0.05的t检验统计学算法为基础，对特征峰进行主成分分析；最后，将第一、第二、第三主成分要素统计结果，依次编为X轴、Y轴和Z轴，建立30批供试品的3D结构模型，观察防风与水防风之间的差异。
[0024]差异性标志物分离纯化的具体方法为：取其中一批水防风供试品粉末1kg，加入95v/v％甲醇3L并浸泡，超声处理，滤过，减压浓缩提取液至干，得到棕褐色油状浸膏，使用硅胶柱层析法对其进行分离，得到高纯度差异性标志物。
[0025]所述硅胶柱层析法具体为：首先以三氯甲烷/甲醇溶剂系统按95∶5
→
50∶50的梯度洗脱，收集75％三氯甲烷/甲醇洗脱的馏分Fr.A；再以正己烷/乙酸乙酯溶剂系统按75∶25
→
30∶70的梯度洗脱馏分Fr.A，收集55％正己烷/乙酸乙酯洗脱的馏分Fr.B；最后使用制备液相对馏分Fr.B进行纯化，流动相为体积比为40:60的乙腈
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水，流速为3.0mL
·
min
‑
1，得到高纯度差异性标志物。
[0026]差异性标志物质谱鉴定的具体步骤为：取步骤(5)制得的高纯度差异性标志物，加入甲醇制成标志物溶液，采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪采集二级质谱碎片图；质谱、色谱条件与步骤(2)相同。
[0027]采用液相色谱仪检测的待测样品溶液的具体制备方法为：取待测样品粉末1g，加入70v/v％甲醇50ml，称定重量，超声处理30min后放冷至室温，再称定重量，用70v/v％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
[0028]采用高效液相色谱
‑
质谱联用仪检测的待测样品溶液的具体制备方法为：取待测样品粉末0.2g，加入70v/v％甲醇100ml，称定重量，超声处理30min后放冷至室温，再称定重量，用70v/v％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
[0029]采用液相色谱仪检测待测样品溶液的方法为：分别吸取对照品溶液与待测样品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定，得到液相色谱图；
[0030]色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为70：30的乙腈
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0.1％磷酸水溶液为流动相；采用二极管阵列检测器，检测波长为222nm。
[0031]采用高效液相色谱
‑
质谱联用仪检测待测样品的方法为：分别吸取对照品溶液与待测样品溶液各1μl，注入高效液相色谱
‑
质谱联用仪进行测定；
[0032]色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱内径2.1mm；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.3ml；
[0033]质谱条件为：采用电喷雾正离子模式，多反应监测，选择m/z 427.2
→
245.1和m/z427.2
→
327.1作为检测离子对。
[0034]本专利技术的有益效果是：一方面，使用HPLC
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TOF
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MS技术对防风与水防风进行统计学分析，建立了两者的差异性PCA模型，并对不同产地的样品进行了聚类分析，统计结果不仅有效鉴别了防风与水防风，还明确了野生和栽培防风的内在差异。另一方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别防风与水防风的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：分别取等量的多批确切来源的防风和水防风样品粉末，各样品粉末中分别加入甲醇，称定重量，超声处理后放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，超高速离心，取上清液，即得各供试品溶液；(2)样品分析：分别取步骤(1)制备的供试品溶液各1μL，采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪分别采集供试品溶液的总离子流图；(3)PCA分析和聚类分析：将步骤(2)所得的质谱原始数据导入MPP数据处理软件，提取特征峰数据，对特征峰进行主成分分析和聚类分析；(4)差异性标志物的筛选：使用MPP数据处理软件的查找特征化合物功能，将防风和水防风分为两组，根据化合物响应值筛选组间的差异化合物，通过解析各差异化合物的提取离子流图，获得峰形好、响应值高、保留时间适中且防风中不存在的差异性标志物；(5)差异性标志物的分离纯化与化学结构鉴定：采用硅胶柱层析法从水防风供试样品中分离纯化出高纯度差异性标志物，通过质谱和核磁鉴定，确定该差异性标志物的结构式为(6)对照品溶液的制备：取差异性标志物加入甲醇，制成每1ml含2μg差异性标志物的溶液；(7)待测样品溶液的制备：取待测样品粉末，加入甲醇，称定重量，超声处理后放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；(8)检测与判定：分别吸取等量对照品溶液与待测样品溶液，注入采用液相色谱仪或高效液相色谱
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质谱联用仪进行检测，得到液相色谱图或提取离子流色谱；若待测样品溶液的液相色谱图中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上未出现相同的色谱峰，判定待测样品为防风；若待测样品溶液的液相色谱图中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上出现相同的色谱峰，则采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在190～400nm波长范围内的紫外
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可见吸收光谱，若紫外
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可见吸收光谱不相同，则判定待测样品为防风，若紫外
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可见吸收光谱相同，则判定待测样品掺杂水防风；若待测样品溶液的提取离子流色谱中，在与对照品溶液色谱峰保留时间相应的位置上未出现相同的色谱峰，则判定待测样品为防风，反之则判定待测样品掺杂水防风。2.如权利要求1所述一种鉴别防风与水防风的检测方法，其特征在于，步骤(1)制备供
试品溶液的具体步骤为：分别取防风和水防风样品粉末各1g，精密称定，分别加入70v/v％甲醇50ml，称定重量，超声处理30min，放冷至室温，再称定重量，用70v/v％甲醇补足减失的重量，摇匀，超高速离心，各取上清液，即得。3.如权利要求1所述一种鉴别防风与水防风的检测方法，其特征在于，步骤(2)进行样品分析的液相色谱条件为：4.6mm
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50mm、2.7μmAgilent Poroshell 120EC
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的色谱柱，流动相：乙腈
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0.1％甲酸溶液，柱温30℃，流速0.5mL
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‑1；质谱条件为电喷雾离子化源，采集模式为正离子模式，干燥气温度为300℃，干燥气流速为5L/min，雾化器压力为35psi，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11L/min，毛细管电压为3500V，喷嘴电压为500V，质量扫描范围为50～1000m/z，碎裂电压为135V。4.如权利要求1所述一种鉴别防风与水防风的...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓俊杰，毛威，谢浙裕，吕林锋，刘刚，朱辉，
申请(专利权)人：绍兴市食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：