中心碳和氨基酸的检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种中心碳和氨基酸的检测方法及其应用，涉及分析化学技术领域，该检测方法可至少检测出26种中心碳和24种氨基酸，该方法包括将经前处理的待测样本与内标混合后使用液相色谱串联质谱检测，然后将检测值带入标准曲线中，计算得到待测样本中中心碳和氨基酸的含量。该方法前处理包括对待测样本使用衍生化试剂3

【技术实现步骤摘要】
中心碳和氨基酸的检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及分析化学
，尤其是涉及一种中心碳和氨基酸的检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]中心碳代谢（CCM）传统意义上包括磷酸腺苷路径（EMP）、磷酸戊糖途径（PP）以及三羧酸循环（TCA），该代谢是生物体所需能量的主要来源，并为体内其他代谢提供前体物质。葡萄糖是最重要的能源物质，起到氧化供能（主要功能）、为脂类和蛋白质的合成提供所需要的碳源、组成糖脂等生理功能，其在生物体内的分解途径主要为中心碳代谢。葡萄糖代谢异常时，可引发机体各种疾病，如糖尿病及其并发症。此外蚕豆病、糖尿病状动脉硬化性心脏病、妊娠糖代谢异常和肝病等疾病的发生也与糖代谢异常密切相关。而乳酸和丙酮酸异常则很可能与糖酵解途径有关。其他糖酵解途径的一些代谢中间体也为脂类、氨基酸及其他一些生物合成提供了前体和原料。
[0003]氨基酸是蛋白质、多肽的基本组成结构和新陈代谢中重要的小分子物质，人体内参与氨基酸代谢的相关蛋白和酶发生缺陷，或者各种病理状态都会导致氨基酸代谢异常和体内氨基酸水平的改变，研究机体在生理和病理条件下氨基酸水平的变化，可以检测机体的营养状况还有助于各种疾病机制认识。
[0004]传统的氨基酸分析方法的衍生方式为使其生成具有紫外或荧光基团的衍生物后进行检测。其方法操作繁琐、影响因素多、分析时间长，给中心碳和氨基酸的检测带来诸多不便。常用的质谱检测手段会出现同分异构体分离度差甚至无法分开的情况，而且有个别物质的灵敏度低，定量限高无法满足检测要求。质谱检测还存在同位素内标价格高且并不是每个标品都可以买到同位素的缺陷，以及内标内源性物质基质效应测试困难的问题。因此，如何改进中心碳和氨基酸的检测方法，是目前有待解决的问题。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的在于提供一种中心碳和氨基酸的检测方法，该方法缓解了现有技术中中心碳和氨基酸检测操作繁琐，同分异构体难移分离的技术问题。
[0007]本专利技术的第二目的在于提供上述检测方法在制备中心碳和氨基酸检测产品中的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种中心碳和氨基酸的检测方法，所述检测方法包括将经前处理的待测样本与内标混合后使用液相色谱串联质谱检测，然后将检测值带入标准曲线中，计算得到待测样本中中心碳和氨基酸的含量；所述前处理包括对待测样本进行衍生化处理；所述内标为经衍生化处理的靶物质；
所述衍生化处理包括将待衍生化样本与衍生化试剂、催化剂和活化剂混合后反应；待测样本的衍生化试剂包括3
‑
NPH，内标的衍生化试剂包括同位素标记的3
‑
NPH；所述催化剂包括吡啶、DMAP或乙酸；所述活化剂包括EDC；所述中心碳包括：葡萄糖
‑1‑
磷酸、一磷酸鸟甘、异柠檬酸、草酰乙酸、磷烯醇丙酮酸、核糖
‑5‑
磷酸、α
‑
酮戊二酸、柠檬酸、5
‑
磷酸木酮糖、丙酮酸、琥珀酸、核酮糖
‑5‑
磷酸、顺式乌头酸、葡萄糖、延胡索酸、葡萄糖醛酸、果糖、反
‑
戊烯二酸、核糖1,5
‑
双磷酸酯钠盐水合物RuDP、中康酸、柠康酸、L
‑
苹果酸、葡萄糖酸、衣康酸和(2S)
‑2‑
羟基戊二酸中的至少一种；所述氨基酸包括：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、肌酸、牛磺酸、肌氨酸、4
‑
氨基丁酸、L
‑
天冬酰胺、丝氨酸和鸟氨酸中的至少一种。
[0009]优选地，衍生化反应的反应体系中，3
‑
NPH和同位素标记的3
‑
NPH的终浓度分别独立的为2.5~50mM，EDC的终浓度为5~50mM；所述催化剂选自吡啶、DAMP或乙酸；所述吡啶的终浓度为0.1~5%v/v；所述DAMP的终浓度为0.1~5%m/v；所述乙酸的终浓度为2~3%v/v。
[0010]优选地，衍生化反应的反应体系中，3
‑
NPH或同位素标记的3
‑
NPH的终浓度为25~40mM，EDC的终浓度为10~30mM；所述催化剂选自吡啶、DAMP或乙酸；所述吡啶的终浓度为1~2%v/v；所述DAMP的终浓度为2%m/v；所述乙酸的终浓度为2.5%v/v。
[0011]优选地，衍生化反应的反应条件为4~50℃反应10~60min。
[0012]优选地，所述待测样本在衍生化反应前经70~95%v/v甲醇水溶液提取，取提取后的上清进行衍生化反应。
[0013]优选地，液相色谱的洗脱程序为：0min，流动相A 98%，流动相B 2%；3min，流动相A 98%，流动相B 2%；6.5min，流动相A 83%，流动相B 17%；7min，流动相A 78%，流动相B 22%；8.5min，流动相A 72%，流动相B 28%；12.5min，流动相A 62%，流动相B 38%；23min，流动相A 25%，流动相B 75%；26min，流动相A 0%，流动相B 100%；28min，流动相A 0%，流动相B 100%；28.1min，流动相A 98%，流动相B 2%；32min，流动相A 98%，流动相B 2%；流动相A为水相，流动相B为有机相；色谱柱选自反相色谱柱T3。
[0014]优选地，流动相A为0.1~0.2%v/v甲酸水；流动相B为乙腈。
[0015]优选地，质谱条件为：电喷雾电离源，离子源温度350℃；离子源电压负/正模式
‑
2500V/3500V；鞘气35psi；辅助气10psi；碰撞气1.5psi；采用多重反应监测进行扫描。
[0016]根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了上述中心碳和氨基酸的检测方法在制备中心碳和氨基酸检测产品中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的检测方法可至少检测出26种中心碳和24种氨基酸。该方法包括将经前处理的待测样本与内标混合后使用液相色谱串联质谱检测，然后将检测值带入标准曲线中，计算得到待测样本中中心碳和氨基酸的含量。该方法前处理包括对待测样本使用衍生化试剂3
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NPH进行衍生化处理，3
‑
NPH能对官能团羧基进行衍生，经3
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NPH衍生的待测样本中
的同分异构体能够在LC
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MS/MS检测过程更好的分离。
[0018]该检测方法的内标为经同位素标记的3
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NPH衍生化的靶物质，通过衍生化处理，将3
‑
NPH带有的同位素引入各靶物质中，使各检测物质均能够获得带有同位素的内标物质，解决了一些待测样本无同位素内标市售本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中心碳和氨基酸的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括将经前处理的待测样本与内标混合后使用液相色谱串联质谱检测，然后将检测值带入标准曲线中，计算得到待测样本中中心碳和氨基酸的含量；所述前处理包括对待测样本进行衍生化处理；所述内标为经衍生化处理的靶物质；所述衍生化处理包括将待衍生化样本与衍生化试剂、催化剂和活化剂混合后反应；待测样本的衍生化试剂包括3
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NPH，内标的衍生化试剂包括同位素标记的3
‑
NPH；所述催化剂包括吡啶、DMAP或乙酸；所述活化剂包括EDC；所述中心碳包括：葡萄糖
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磷酸、一磷酸鸟甘、异柠檬酸、草酰乙酸、磷烯醇丙酮酸、核糖
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磷酸、α
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酮戊二酸、柠檬酸、5
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磷酸木酮糖、丙酮酸、琥珀酸、核酮糖
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磷酸、顺式乌头酸、葡萄糖、延胡索酸、葡萄糖醛酸、果糖、反
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戊烯二酸、核糖1,5
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双磷酸酯钠盐水合物RuDP、中康酸、柠康酸、L
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苹果酸、葡萄糖酸、衣康酸和(2S)
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羟基戊二酸；所述氨基酸包括：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、肌酸、牛磺酸、肌氨酸、4
‑
氨基丁酸、L
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天冬酰胺、丝氨酸和鸟氨酸。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，衍生化反应的反应体系中，3
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NPH和同位素标记的3
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NPH的终浓度分别独立的为2.5~50mM，EDC的终浓度为5~50mM；所述催化剂选自吡啶、DAMP或乙酸；所述吡啶的终浓度为0.1~5%v/v；所述DAMP的终浓度为0.1~5%m/v；所述乙酸的终浓度为2~3%v/v。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷焕娜，赵晓雯，余文祥，赵亚丽，
申请(专利权)人：北京诺禾致源科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：