一种产无前导肽细菌素的枯草芽孢杆菌及制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种产无前导肽细菌素的枯草芽孢杆菌及制备方法与应用，属于医药应用领域。本发明专利技术公开的枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25552。利用所述的枯草芽孢杆菌发酵培养，得到发酵液；分离所述发酵液收集上清液，利用离子交换树脂、高相液相色谱分离纯化所述上清液，得到细菌素制品。经实验验证，所得细菌制品具有较好的抑制多种病原菌的作用，在动物养殖、食品防腐、医药健康领域，制备菌剂、抗菌药物等方面具有广泛的应用前景。药物等方面具有广泛的应用前景。药物等方面具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种产无前导肽细菌素的枯草芽孢杆菌及制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及医药应用领域，特别是涉及一种产无前导肽细菌素的枯草芽孢杆菌及制备方法与应用。

技术介绍

[0002]细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的、对产生菌具有自身免疫性的一类具有抗菌活性的多肽类物质。细菌素在生物合成、作用模式、抗性机制及抗菌活性方面与抗生素存在明显不同，被认为是抗生素的最佳替代品，目前研究最多最深入的是羊毛硫细菌素。细菌素在食品防腐、动物养殖及医药治疗等方面有广泛应用。然而，产量较低，规模化生产较难，成本较高等因素制约了细菌素的大范围应用。与大多数细菌素不同，无前导肽细菌素是一类由核糖体合成、翻译后不进行任何修饰即具有活性的细菌素，该类细菌素遗传结构简单，易在其它微生物细胞中表达，便于通过生物工程进行规模化生产，抗菌机制独特，有巨大的商业应用潜能。而该类细菌素到鉴定和报道的很少，到目前为止仅有19种来自不同种属细菌的无前导肽细菌素获得鉴定。
[0003]首次报道的无前导肽细菌素是1998年由菌株E.faecium L50产生的含有两条肽链的细菌素Enterocin L50(EntL50)。除此之外，有来自屎肠球菌的EntQ、Enterocin K1(EntK1)，来自粪肠球菌的Enterocin EJ97(EntEJ97)、Enterocin 7(Ent7,与报道的Enterocin MR10相同)，来自金黄色葡萄球菌的Aureocin A53(Aur53)、Aureocin A70(Aur70)，来源于表皮葡萄球菌的Epidermicin NI01(EpiNI01)，来自于乳酸乳球菌的Lacticin Q(LnqQ)、Lacticin Z((LnqZ)、LsbB、Lactolisterin BU(LliBU)，来源于鼠链球菌的BHT
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B，来源于希腊魏氏杆菌的Weisselicin Y(WelY)、Weisselicin M(WelM)，来源于格氏乳球菌的GarKS，来源于蜡样芽孢杆菌的Cereucin X(CerX)、Cereucin H(CerH)、Cereucin V(CerV)。由于不同的无前导肽细菌素具有不同的抗菌机制和抗菌谱，因此新型无前导肽细菌素产生菌的筛选对新型细菌素的开发和应用具有重要意义.

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种产无前导肽细菌素的枯草芽孢杆菌及制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题，该枯草芽孢杆菌能够产生无前导肽细菌素，并且该无前导肽细菌素具有较好的抑制多种病原菌的作用，在动物养殖、食品防腐、医药健康领域，制备菌剂、抗菌药物等方面具有广泛的应用前景。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25552；保藏时间为2022年8月19日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007]本专利技术还提供由所述的枯草芽孢杆菌产生的细菌素。
[0008]优选的是，所述细菌素为无前导肽细菌素。更优选的是，所述无前导肽细菌素为细
菌素sucitin A1、细菌素sucitin A2、细菌素sucitin A3，细菌素subticin A1的氨基酸序列为MIAFLRIVAQLGARAARWAWANKDRVLGWIRDGMAIDWIINKINDMVS；subticin A2的氨基酸序列为MITFLRIVAQLGARAAKWAWANKDRVLNWIKNGVAIDWIIDKINDMVN；subticin A3的氨基酸序列为MVTFLRIVAQLGARAARWAWANKDRILGWIRDGMAIDWIINKINDMVN。更优选的是，细菌素sucitin A1、细菌素sucitin A2、细菌素sucitin A3的氨基酸序列中第一个氨基酸甲酰化为甲酰甲硫氨酸。
[0009]本专利技术还提供一种所述的枯草芽孢杆菌的发酵培养方法，将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基，在37℃，220rpm振摇培养8h，得到发酵液。
[0010]本专利技术还提供一种细菌素的生产方法，包括以下步骤：
[0011](1)利用所述的枯草芽孢杆菌发酵培养，得到发酵液；
[0012](2)分离所述发酵液收集上清液，利用离子交换树脂、高相液相色谱分离纯化所述上清液，得到细菌素制品。
[0013]优选的是，步骤(1)中，利用上述的方法发酵培养所述枯草芽孢杆菌。
[0014]优选的是，步骤(2)中，将所述上清液经所述离子交换树脂Amberlite XAD7HP交换，分别用蒸馏水、30％乙醇、80％乙醇洗脱，获取活性组分。
[0015]优选的是，所述活性组分经低温旋蒸浓缩后，再用所述高相液相色谱分离纯化；其中，分离纯化的色谱条件为：色谱柱TC
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C18；流动相乙腈，流速1mL/min，梯度洗脱程序为乙腈浓度由10％增加到80％洗脱55min，分别收集保留时间为49min、50min及51min的馏分，得到所述细菌素制品。
[0016]本专利技术还提供一种产品，包括所述的枯草芽孢杆菌或者所述的细菌素。
[0017]本专利技术还提供一种所述的枯草芽孢杆菌或者所述的细菌素在制备菌剂或者抗菌药物中的应用。
[0018]本专利技术公开了以下技术效果：
[0019]本专利技术通过在土壤中分离纯化获取一株能够产生无前导肽细菌素的枯草芽孢杆菌，通过分离枯草芽孢杆菌发酵液得到三种细菌素，经质谱分析，这三种细菌素的氨基酸序列和现有的细菌素不同，因此，均为为新型细菌素。在经过实验验证发现，无前导肽细菌素subticin A1对肉毒梭菌等多种食源性病原菌有较好的抗菌活性；无前导肽细菌素subticin A2和subticin A3对猪链球菌、乙型溶血链球菌有较好的抗菌活性。因此，本专利技术新分离的枯草芽孢杆菌以及新分离的细菌素在动物养殖、食品防腐、医药健康领域，制备菌剂、抗菌药物等方面具有广泛的应用前景。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZXF04所产细菌素一级质谱分析；A：subticin A1；B：subticin A2；C：subticin A3；
[0022]图2为细菌素subticin A1、A2、A3的HPLC分离纯化结果。
具体实施方式
[0023]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25552。2.由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌产生的细菌素。3.如权利要求2所述的细菌素，其特征在于，所述细菌素为无前导肽细菌素。4.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基，在37℃，220rpm振摇培养8h，得到发酵液。5.一种细菌素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵培养，得到发酵液；(2)分离所述发酵液收集上清液，利用离子交换树脂、高相液相色谱分离纯化所述上清液，经冷冻干燥得到细菌素制品。6.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，利用权利要求4所述的方法发酵培养所述枯草芽孢杆菌。7.如权利要求5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓峰，王蕴哲，余海尤，李学思，潘春梅，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：