一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用，属于生物技术领域。本发明专利技术涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2022856，保藏日期为2022年6月10日。该枯草芽孢杆菌分离于大连地区海参人工养殖水体环境，在15

【技术实现步骤摘要】
一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用。

技术介绍

[0002]我国水产养殖产品种类丰富，以海参为例，其具有高蛋白、低糖低脂等特点，参体蛋白含量高达80％，且富含必需氨基酸及脂肪酸、维生素、酸性粘多糖、皂苷和胶原蛋白等有效活性成分，具有显著的抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血压、降血脂、增强免疫等功效。截止2019年，我国海参养殖面积达到24.67万公顷，年产量17.17万吨，养殖规模居世界第一，直接经济收益超过300亿元。然而，海参养殖易受到假单胞菌、灿烂弧菌、霉菌等致病菌侵害，发病多见腐皮综合征、烂胃病、霉菌病等病害，传统防病治病手段多使用四环素类、磺胺类、喹诺酮类、酰胺醇类、大环内酯类抗生素。2020年，我国全面禁止使用抗生素，需每年组织开展兽药残留监控和动物源细菌耐药性监测。因而，亟待开发绿色替抗及高效水产养殖技术，满足海参等水产动物的快速生长发育与增产增重需要，同时提高成活率、减少发病率，已成为国外内研究学者和养殖业者的关注热点。
[0003]目前，海参饲用益生菌主要使用芽孢杆菌、乳杆菌、酵母等微生物。枯草芽孢杆菌是一种广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁衍的革兰氏阳性菌，可形成内生抗逆芽孢，适宜生长温度在37℃左右，pH在7.0左右。枯草芽孢杆菌代谢途径复杂，能够合成包括酶类、细菌素类、多肽类、有机酸、维生素在内的多种次级代谢产物，主要用于生产枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、B族维生素等抑菌活性物质与生长必须调节剂。其在海参等水产养殖行业具有重要应用，对养殖水体及机体内弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等致病菌具有抑制作用，分泌复合降解酶系可分解有毒有害物质，促进水产动物免疫器官发育，增强机体免疫力，提高营养吸收利用。
[0004]现有枯草芽孢杆菌菌种适宜发酵温度大多为30
‑
37℃，而海参等水产养殖适宜温度范围为15
‑
25℃，普遍使用或报道的枯草芽孢杆菌菌种低温耐受性不足，无法在低温环境保持较高活力的生长代谢及生防拮抗特性，不能很好的满足水产养殖需求。中国专利CN114107120A公开了一种由乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌组成的复合菌群制剂，其中芽孢杆菌在温度30～37℃、pH5.0～6.0、转速120～200rpm、发酵时间36～48h情况下，芽孢杆菌活菌数CFU达6.0
×
10
10
。中国专利CN113773996A公开了一种饲用枯草芽孢杆菌高密度制备方法，以2％～10％(v/v)接入发酵培养基，在温度25～42℃条件下，发酵20～48h后有效活菌数为5.8
×
10
10
cfu/g。可见，目前枯草芽孢杆菌培养及应用环境局限于25℃以上，并不适用于低温水产养殖环境。因而，兼顾低温耐受性与致病菌拮抗特性，筛选优良的枯草芽孢杆菌菌种资源，以适应低温环境养殖特点，提高枯草芽孢杆菌细胞生长速率、有效活菌数及其拮抗作用活性产物浓度，对于提高低温环境下益生菌活力及其生物效价、提升低温水产养殖产能尤为重要。本专利技术中涉及的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，在15～25℃低温环境下，24
‑
96h内发酵有效活菌数≥10
11
cfu/mL，能够高效拮抗多种海参致病菌，具有
重要实际应用意义和规模化生产价值。

技术实现思路

[0005]为解决现有枯草芽孢杆菌菌种在海参等低温水产养殖环境中(15
‑
25℃)，由于低温耐受性不足，造成细胞生长速率缓慢、有效活菌数低，进而影响菌体生长与生防拮抗效果的实际问题，本专利技术提供了一株耐低温生防芽孢杆菌及其水产致病菌拮抗应用。
[0006]本专利技术一方面提供了一株耐低温生防芽孢杆菌，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，经鉴定分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，该菌株已于2022年6月10日在中国典型培养物保藏中心保藏(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)，保藏编号为：CCTCC M 2022856。
[0007]进一步地，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021在低温环境下的水产致病菌拮抗应用。
[0008]上述应用中，所述的水产养殖致病菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌或哈维氏弧菌等。
[0009]进一步地，所述的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021的水产致病菌拮抗应用方法，即添加使用1％
‑
10％发酵菌剂，所述发酵菌剂的有效成分为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021及其发酵产物，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵菌液。
[0010]进一步地，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵温度为15
‑
25℃，24
‑
96h内发酵菌液有效活菌数≥10
11
cfu/mL。
[0011]进一步地，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵菌液制备方法，包括以下步骤：
[0012](1)无菌条件下将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021保藏液稀释涂布于平板培养基，30
‑
37℃恒温静置培养24
‑
36h后，使用无菌水收集平板培养基上孢子，制备孢子浓度108‑
10
10
个/mL的孢子悬液；
[0013](2)在无菌条件下将上述步骤(1)中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30
‑
37℃，150
‑
200rpm振荡培养24
‑
48h，制备液体种子液；
[0014](3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，15
‑
25℃，150
‑
200rpm，通入无菌空气发酵培养24
‑
96h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021有效活菌数≥10
11
cfu/mL。
[0015]进一步地，所述种子培养基及发酵培养基的组成按质量百分比为：葡萄糖4％、牛肉膏2％、酵母粉1％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、七水硫酸镁0.06％、磷酸二氢钾0.2％；用50％氨水溶液将培养基pH调至6.5
‑
7.0。
[0016]本专利技术所提供的耐低温生防芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，在15
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株耐低温生防芽孢杆菌，分离于大连地区海参人工养殖水体环境，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021，保藏编号为：CCTCC M 2022856。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，在低温环境下的水产致病菌拮抗应用。3.根据权利要求2所述的水产致病菌拮抗应用，其特征在于：所述的水产致病菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、黄海希瓦氏菌或哈维氏弧菌。4.根据权利要求2或3所述的水产致病菌拮抗应用，其特征在于：添加使用1％
‑
10％发酵菌剂，所述发酵菌剂的有效成分为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021及其发酵产物，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵菌液。5.根据权利要求4所述的水产致病菌拮抗应用，其特征在于，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021发酵温度为15
‑
25℃，24
‑
96h内发酵菌液有效活菌数≥10
11
cfu/mL。6.根据权利要求4或5所述的水产致病菌拮抗应用其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CTB2021的发酵菌液制备，包括以下步骤：(1)无菌条件下将枯草芽孢杆菌(Bacillus subti...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴又多，王国旭，薛闯，
申请(专利权)人：大连理工大学宁波研究院，
类型：发明
国别省市：