一种刺山柑提取物D95及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医药领域。本发明专利技术提供了一种刺山柑提取物D95的制备方法，以分布在新疆的刺山柑为实验材料，对刺山柑醇提物组分优化提取工艺，并进一步分离纯化；将刺山柑正丁醇萃取相进一步经大孔树脂柱分离得到95％乙醇洗脱组分，提取物D95。本发明专利技术还提供了一种所述制备方法制得的刺山柑提取物D95，以及所述刺山柑提取物D95在制备免疫抑制药物中的应用。通过本发明专利技术技术方案获得的刺山柑提取物D95在体外与体内实验中，均表现出抑制DC成熟的能力及抗炎能力，显示D95具有免疫抑制的作用。显示D95具有免疫抑制的作用。显示D95具有免疫抑制的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种刺山柑提取物D95及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种刺山柑提取物D95及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]树突状细胞(dendritic cell，DC)作为专职的抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，在免疫系统中发挥着作为先天性免疫和获得性免疫中重要组分的作用，将捕获到的内源性或外源性抗原经内源性或外源性途径加工成多肽。多肽与DC表面的组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)结合所形成的多肽复合物(pMHC)可以被CD8
+
或CD4
+
T细胞表面的受体(T cell receptor，TCR)识别，从而促进免疫或免疫耐受。DC的成熟度决定着免疫反应的强度和类型，参与Th细胞的分化，包括Th1、Th2、Th17、Treg等。通过抑制DC的成熟从而调节Th1/Th2平衡来调节Th17/Tregs平衡。DC的成熟与各种炎症因子的分泌密切相关，例如IL
‑
6、IL
‑
1β、TNF
‑
α和IL
‑
23等炎症性因子的分泌会增加。成熟的DC能够刺激T细胞的激活以及增殖。同时成熟的DC其功能会发生转变，抗原吞噬能力减弱、递呈能力增强。而脂多糖(微生物产物，LPS)能够通过Toll样受体(Toll
‑
like receptors，TLRs)促进DC的成熟。因此，DC可以作为RA治疗的一个重要靶点，开发其免疫调节能力可以为癌症和自身免疫性疾病的治疗提供有效的策略。
[0003]中药在免疫调节以及抗肿瘤方面的卓越功效越来越被研究人员所关注，据《新疆药用植物志》记载，刺山柑叶、果和根皮均可入药，主要有祛风除湿、止痛、消肿等功效，外敷患处可以治风湿性关节炎和疮毒，其中的刺山柑叶醇提物更是具有一定的免疫抑制作用。而基于中药刺山柑的醇提物在免疫调节中的卓越作用，可进行深入的研究，充分发挥其在免疫调节方面的作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种刺山柑提取物D95及其制备方法和应用，本专利技术所获得的刺山柑提取物D95具有可抑制DC成熟的能力及抗炎能力，即具有显著免疫抑制作用。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种刺山柑提取物D95的制备方法，具体包括如下步骤：
[0007](1)将粉碎的刺山柑果实与乙醇混合，超声处理后，提取，收集提取液；
[0008](2)将步骤(1)收集的提取液去除乙醇后，与水、NaCl混合，再经萃取、浓缩处理得到粗提物；
[0009](3)将所述粗提物进行D101大孔树脂柱分离洗脱，收集95％乙醇洗脱相即得到提取物D95。
[0010]作为优选，与粉碎后的刺山柑果实混合的乙醇的体积浓度为90
‑
97％，所述粉碎的刺山柑果实与乙醇的料液比为1：(4
‑
8)。在混合完成后，进行超声处理和提取，所述超声处理的时间为10
‑
30min，所述提取的温度为50
‑
70℃，所述提取的时间为1
‑
3h，所述提取的次
数为1
‑
5次。
[0011]作为优选，将收集的提取液进行去除乙醇处理，所述去除乙醇处理是通过旋转蒸发浓缩的方式实现，所述旋转蒸发浓缩的温度为50
‑
70℃；所述萃取过程使用的萃取剂依次为石油醚、乙酸乙酯和水饱合正丁醇，每种溶剂的萃取次数为1
‑
5次；所述浓缩处理的温度为50
‑
70℃。
[0012]作为优选，对所得到的粗提取还要进行D101大孔树脂柱分离洗脱处理，所述D101大孔树脂柱分离的流动相选用蒸馏水和10％
‑
95％乙醇，柱体积为2.0
‑
3.0L，上样量20
‑
30g，流速为1
‑
3BV/h。
[0013]本专利技术还提供了一种所述制备方法制得的刺山柑提取物D95。
[0014]本专利技术还提供了一种所述的刺山柑提取物D95在制备免疫抑制药物中的应用。
[0015]本专利技术还提供了一种所述的刺山柑提取物D95在制备抑制DC细胞成熟的试剂中的应用。
[0016]通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
[0017]采用本专利技术技术方案得到的刺山柑提取物D95，在体外实验中，降低了LPS诱导的DC表面分子及炎症细胞因子的表达水平，提高了DC摄取抗原的能力，降低了DC的迁移能力，降低了LPS诱导的DC刺激小鼠脾脏CD4
+
T与CD8
+
T淋巴细胞增殖的能力。在小鼠体内试验中，刺山柑提取物D95显著降低了LPS诱导的小鼠体内DC表面分子的表达水平，降低了TPA诱导的小鼠耳组织中炎症细胞因子的表达水平，显著恢复了角叉菜胶诱导的足趾肿胀模型小鼠脾脏中免疫细胞的平衡。在体外与体内实验中，D95均表现出抑制DC成熟的能力及抗炎能力，显示D95具有免疫抑制的作用。这为筛选安全、高效的免疫抑制剂提供候选材料，也为癌症和自身免疫性疾病的治疗提供有效的策略。
附图说明
[0018]图1为不同处理对凋亡细胞和坏死细胞的影响(其中，(A)为对凋亡细胞的影响，(B)为对坏死细胞的影响)；
[0019]图2为D95处理DC后，DC表面分子和细胞因子表达水平的结果(其中，(A)为流式峰图和平均荧光强度统计图，(B)为表面分子CD40表达水平，(C)为表面分子CD86表达水平，(D)为细胞因子IL
‑
6表达水平，(E)为细胞因子IL
‑
12p40表达水平，(F)为细胞因子IL
‑
1β表达水平，(G)为细胞因子TNF
‑
α表达水平)；
[0020]图3为D95对LPS诱导的DC表面分子表达水平和炎症细胞因子水平的结果(其中(A)为平均荧光强度统计图，(B)为CD40表达水平，(C)为CD86表达水平，(D)为细胞因子IL
‑
6表达水平，(E)为细胞因子TNF
‑
α表达水平，(F)为细胞因子IL
‑
23表达水平，(G)为细胞因子IL
‑
12p40表达水平，(H)为细胞因子IL
‑
1β表达水平，(I)为细胞因子IL
‑
10表达水平，(J)平均荧光强度统计图)；
[0021]图4为以FITC
‑
Dextran作为抗原的，D95对LPS诱导的DC表面分子表达水平和炎症细胞因子水平的结果(其中(A)为流式峰图，(B)为平均荧光强度统计图)；
[0022]图5为D95降低DC刺激同种异体T细胞增殖的结果，不同处理对DC表面分子表达水平、炎症本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种刺山柑提取物D95的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将粉碎的刺山柑果实与乙醇混合，超声处理后，提取，收集提取液；(2)将步骤(1)收集的提取液去除乙醇后，与水、NaCl混合，再经萃取、浓缩处理得到粗提物；(3)将所述粗提物进行D101大孔树脂柱分离洗脱，收集95％乙醇洗脱相即得到提取物D95。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙醇的体积浓度为90
‑
97％；所述粉碎的刺山柑果实与乙醇的料液比为1：(4
‑
8)；所述超声处理的时间为10
‑
30min；所述提取的温度为50
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70℃，所述提取的时间为1
‑
3h，所述提取的次数为1
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5次。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述去除乙醇是通过旋...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金耀，马荣斌，刘晓颖，阿力木，
申请(专利权)人：新疆前进荣耀投资有限公司，
类型：发明
国别省市：