CADASIL疾病模型犬的建立方法技术

本发明专利技术涉及用于建立Notch3基因敲除型皮质下梗死伴白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)模型犬的方法，以及获得的Notch3基因敲除型CADASIL疾病模型犬及其细胞、组织和器官，使利用犬作为CADASIL疾病动物模型研究变得可行。模型研究变得可行。

【技术实现步骤摘要】
CADASIL疾病模型犬的建立方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及用于建立CADASIL疾病模型犬的方法。

技术介绍

[0002]皮质下梗死伴白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarct and leukoencephalopathy)又称CADASIL，是一种常见的遗传性脑小动脉病。Sourander和于1977年首先报道了该病的临床特征，其通常于中年起病，临床表现主要为脑白质病、痴呆，伴有头痛、假性延髄性麻痹和抑郁。该病的发病率约为(2～5)/10万，而实际上可能更高。
[0003]随着生物学领域的快速发展，研究者们发现CADASIL具有明显的常染色体显性遗传特点，其导致的血管病变主要与Notch3(Notch receptor 3，Notch受体3)基因发生突变有关。NOTCH3致病性变异大部分为错义突变(95％)，约60％位于3、4、5、8号外显子，3号和4号外显子为中国CADASIL患者的热点突变区。NOTCH3基因的致病性变异常发生于2～24号外显子，导致EGFR内奇数半胱氨酸残基形成，影响二硫键的两两结合而改变蛋白质构象，最终导致NOTCH3
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ECD的异常积聚。近期研究表明，脑以及其他外周器官小血管内NOTCH3
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ECD异常堆积是CADASIL的核心事件，促进了功能性细胞外基质蛋白异常聚集并产生细胞毒性作用，最终导致平滑肌细胞变性。通过对CADASIL患者进行血流动力学研究，研究者们推测脑血流失调可能是CADASIL疾病发生的主要原因。
[0004]为了探索相关的疾病发生机制，研究者们构建了多种针对Notch3基因表达缺失或突变的大鼠和小鼠模型。这些模型一定程度上可以模拟CADASIL临床患者部分病理表型，如出现全身水平的VSMC的退化及动脉能力受损，但却极少会出现临床CADASIL患者最为显著的
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脑动脉退化的病理改变。其主要原因可能是由于小鼠/大鼠寿命较短，脑部尺寸较小，突变Notch3组织特异性过表达水平不同等，从而导致大/小鼠CADASIL模型可能出现脑白质异常增多的变化，却无法模拟CADASIL临床患者MRI检测显示的腔隙性梗死现象，很大程度上阻碍了模型应用于临床转化及相关药物的开发研究。
[0005]因此，亟需寻找新的动物模型，能够更好地模拟CADASIL临床患者病理表型，以用于临床转化及相关药物的开发研究。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中存在的问题，基于犬在血管结构以及组成大小上与人具有的高度相似性，本专利技术提供了一种经基因编辑技术建立Notch3(Notch受体3)基因敲除皮质下梗死伴白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)模型犬的方法。本专利技术还涉及所建立的Notch3基因敲除型CADASIL犬模型，其细胞和组织。
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种用于建立皮质下梗死伴白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)模型犬的方法，所述方法包括如下步骤：利用基因编辑技术获得Notch3基因敲除的犬受精卵或犬体细胞。
[0008]在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。
[0009]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0010](1)根据犬Notch3基因序列的3号外显子的序列确定打靶位点；
[0011](2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；
[0012](3)通过体外转录，分别获得sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物；
[0013](4)将步骤(3)获得的体外转录产物导入犬受精卵或犬体细胞中，获得Notch3基因敲除的犬受精卵或犬体细胞。
[0014]在一些实施方式中，根据Notch3基因序列的3号外显子确定3个打靶位点。优选地，所述打靶位点的sgRNA序列及其互补序列包括以下序列：
[0015]S1位点：CGTCTGCCAGAGTTCCGTGGTGG(SEQ ID NO:2)，互补序列为CCACCACGGAACTCTGGCAGACG(SEQ ID NO:3)；
[0016]S2位点：TCCCTTACCTCGGAAGCCACGGG(SEQ ID NO:4)，互补序列为CCCGTGGCTTCCGAGGTAAGGGA(SEQ ID NO:5)；
[0017]S3位点：AATGGCAGGGGTCCTCCAGCTGG(SEQ ID NO:6)，互补序列为CCAGCTGGAGGACCCCTGCCATT(SEQ ID NO:7)。
[0018]在一些实施方式中，所述犬体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。
[0019]在一些实施方式中，所述犬体细胞选自胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。
[0020]在一些实施方式中，所述方法还包括将获得的Notch3基因敲除的犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备CADASIL疾病模型犬。
[0021]在一些实施方式中，所述方法还包括将获得的Notch3基因敲除的犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬的输卵管内，从而制备CADASIL疾病模型犬。
[0022]在一些实施方式中，本专利技术利用基因编辑技术，根据犬Notch3基因序列的外显子选择打靶位点序列，并且根据打靶位点序列构建了sgRNA打靶载体和CRISPR/Cas9表达载体，载体经验证有效后，体外转录为mRNA，然后采用胞质注射的方式将mRNA注射入犬受精卵中，然后将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备Notch3基因敲除型CADASIL疾病模型犬。
[0023]在第二方面，本专利技术提供了犬Notch3基因敲除的打靶载体，所述打靶载体由针对犬Notch3基因3号外显子中的打靶位点序列设计的sgRNA序列以及骨架载体构成。
[0024]在一些实施方式中，根据Notch3基因序列的3号外显子设计3个打靶位点，所述打靶位点的sgRNA序列及其互补序列包括以下序列：
[0025]S1位点：CGTCTGCCAGAGTTCCGTGGTGG(SEQ ID NO:2)，互补序列为CCACCACGGAACTCTGGCAGACG(SEQ ID NO:3)；
[0026]S2位点：TCCCTTACCTCGGAAGCCACGGG(SEQ ID NO:4)，互补序列为
CCCGTGGCTTCCGAGGTAAGGGA(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.皮质下梗死伴白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)疾病模型犬的建立方法，所述方法包括如下步骤：利用基因编辑技术获得Notch3基因敲除的犬受精卵或犬体细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据犬Notch3基因序列的3号外显子的序列确定打靶位点；(2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；(3)通过体外转录，分别获得sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物；(4)将步骤(3)获得的sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物导入犬受精卵或犬体细胞中，获得Notch3基因敲除的犬受精卵或犬体细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，根据犬Notch3基因序列的3号外显子的序列确定3个打靶位点，优选地，所述打靶位点的sgRNA序列及其互补序列包括以下序列：S1位点：CGTCTGCCAGAGTTCCGTGGTGG(SEQ ID NO:2)，互补序列为CCACCACGGAACTCTGGCAGACG(SEQ ID NO:3)；S2位点：TCCCTTACCTCGGAAGCCACGGG(SEQ ID NO:4)，互补序列为CCCGTGGCTTCCGAGGTAAGGGA(SEQ ID NO:5)；S3位点：AATGGCAGGGGTCCTCCAGCTGG(SEQ ID NO:6)，互补序列为CCAGCTGGAGGACCCCTGCCATT(SEQ ID NO:7)。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述犬体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将获得的Notch3基因敲除的犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备CADASIL疾病模型犬。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将获得的Notch3基因敲除的犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬...

【专利技术属性】
技术研发人员：米继东，赵建平，吉训明，邵海涛，杨旗，
申请(专利权)人：首都医科大学脑重大疾病研究中心北京脑重大疾病研究院，
类型：发明
国别省市：