本发明专利技术属于生物分子检测领域，更具体地说，涉及一种检测肠癌基因靶向药位点的探针组合、试剂盒及检测方法，其中，探针组合包含有针对22个基因的探针，所述22个基因为：AKT1基因、ALK基因、BRAF基因、ERBB2基因、ERBB4基因、FBXW7基因、KRAS基因、MAP2K1基因、MET基因、PTEN基因、SMAD4基因、STK11基因、CTNNB1基因、DDR2基因、EGFR基因、FGFR1基因、FGFR2基因、FGFR3基因、NOTCH基因、NRAS基因、PIK3CA基因、TP53基因。本发明专利技术针对单碱基突变，插入，缺失，大片断拷贝，基因融合等情况，筛选22个基因，设计了特异性探针，具有特异性强，检测更多肺癌位点的特点，测序成本更低，可靠性更强。可靠性更强。
【技术实现步骤摘要】
一种检测肠癌基因靶向药位点的探针组合、试剂盒及检测方法
[0001]本专利技术属于生物分子检测领域，更具体地说，涉及一种检测肠癌基因靶向药位点的探针组合、试剂盒及检测方法。
技术介绍
[0002]目前，传统的肠癌治疗方式有：外科手术治疗、放疗和化疗等。外科手术治疗虽然可以切除肿瘤，但是手术过程中可能无法完全切除或引起肿瘤转移，还可能造成器官损伤及身体免疫力降低；化疗是一种全身性的治疗，效果明显和迅速，但是在杀伤肿瘤细胞的同时也可能会把正常细胞一起杀灭；放疗在某些肿瘤方面可以达到手术切除的效果，但放疗成本高，周期长，并发症多。
[0003]对于采用何种治疗方式，临床上对肠癌仍以组织病理学诊断为确诊和治疗的依据。往往缺乏有效的早期诊断手段，使得大多数患者在确诊时已是中晚期，错过了最佳治疗时间。
[0004]近年来，分子靶向治疗作为一种新兴治疗手段，使用药物针对已经明确的致癌基因，特异地杀死肿瘤细胞，因此分子靶向治疗的副作用更小和特异性更高，能够大大提升患者生存周期以及生活质量而得到广泛的应用。然而分子靶向治疗依赖于患者的基因分型，靶向药物往往有其对应的靶基因，分子靶向治疗需要明确肿瘤患者存在可靶向治疗的基因突变。因此针对肠癌的靶基因突变位点的检测技术的开发是应用靶向治疗的基础。
[0005]目前，对于肠癌靶基因突变位点的检测，一类是市场上已有的用于肠癌基因检测的panel囊括的基因不全面，针对肠癌相关基因的捕获非常少，会遗漏很多重要的基因突变信息，又或者涵盖一些与肠癌不是很相关的基因，不能全面有效的反映肠癌及肠癌相关基因的突变。而一些大panel肿瘤试剂盒，通常包括上百种基因，要求比较高的建库起始量，成本高，测序灵敏度和准确性都比较低。再一类，对癌症进行全基因组或全外显子测序可以获得海量的基因突变数据。然而，这些测序费用极其昂贵，后期数据分析要求极高、耗时长达数月，无法应用于临床需求。
技术实现思路
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种检测肠癌基因的靶向药位点的试剂盒，从众多的肠癌相关基因中挑选了22个基因，针对单碱基突变，插入，缺失，大片断拷贝，基因融合等情况，设计了特异性探针，具有特异性强，成本低，检测更多肠癌位点的特点。
[0007]一种检测肠癌基因靶向药位点的探针组合，包含有针对22个基因的探针，所述22个基因为：AKT1基因、ALK基因、BRAF基因、ERBB2基因、ERBB4基因、FBXW7基因、KRAS基因、MAP2K1基因、MET基因、PTEN基因、SMAD4基因、STK11基因、CTNNB1基因、DDR2基因、EGFR基因、FGFR1基因、FGFR2基因、FGFR3基因、NOTCH1基因、NRAS基因、PIK3CA基因、TP53基因。
[0008]现有技术中基于肠癌基因的检测方法，市场上已有的用于肠癌基因检测的panel
囊括的基因不全面，针对肠癌相关基因的捕获非常少，会遗漏很多重要的基因突变信息，又或者涵盖一些与肠癌不是很相关的基因，不能全面有效的反映肠癌及肠癌相关基因的突变。而一些大panel肿瘤试剂盒，通常包括上百种基因，要求比较高的建库起始量，成本高，测序灵敏度和准确性都比较低。
[0009]本专利技术中，为了精细化肠癌的检测位点，根据【NCCN结直肠癌临床实践指南】，并且结合ONCOKB数据库，挑选了22个最权威的基因，针对单碱基突变，插入，缺失，大片断拷贝，基因融合等情况，设计了特异性探针，并且使用UMI分子标签来大幅降低分析结果的假阳性，用于检测肠癌基因的靶向药位点，具有特异性强，成本低，检测更多肠癌位点的特点，提高了肠癌基因检测准确度。
[0010]根据上面筛选出核心的22个基因和对应的核心基因区域，确定探针补获区域，生成捕获区域的bed文件。
[0011]根据上述生成的bed文件和人类hg19参考基因组，通过catch[4]软件设计目标区域探针序列，将设计的探针序列通过blastn和hg19比对，找出探针序列中能多处比对到hg19的序列并将其去除，得到唯一对比到hg19的探针序列。
[0012]上述22个基因对应的探针序列如下表1：
[0013]表1 22个基因对应的探针序列
[0014][0015][0016][0017][0018][0019]本专利技术的第二方面，是提供一种检测肠癌基因靶向药位点的试剂盒，包含有上述的探针。
[0020]本专利技术的第三方面，提供利用上述试剂盒检测肠癌基因突变位点的方法，包括如下步骤：S
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1.提取待测样品DNA；
[0021]所检测的样品可以是血液、组织等任何可以提取到DNA的样品。
[0022]提取DNA的试剂盒有很多种，如：QIAGEN公司的血浆/血清游离DNA提取试剂盒、厦门艾德公司的血浆游离DNA提取试剂盒、天根的血浆/血清游离DNA提取试剂盒等。提取步骤参考对应试剂盒说明书。
[0023]S
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2.构建DNA文库；
[0024]文库的构建可以采用市面上多种产品实现，例如：Twist试剂盒、KAPA HTP Library Preparation Kit、Ultra
TM DNA Library Prep Kit for等。
[0025]S
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3.22个靶向药基因的捕获；
[0026]S
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4.扩增、纯化；
[0027]S
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5.测序、分析。
[0028]具体地操作，如下：
[0029]S
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1.提取待测样品DNA。
[0030]取血浆X ml于15ml EP管，加50*X ul ProK和150*X ul SDS，充分振荡混匀，60℃，20min。再向各管中加入1.25*X ml Buffer B和60*X ul Particles G，振荡混匀后于垂直混匀仪慢速混匀6min，瞬时离心后置于磁力架，待溶液澄清后，弃上清。加1ml Buffer W1，涡旋混匀15s，瞬时离心收集后将管置于磁力架，静置至溶液澄清后，弃上清。加1ml Buffer W2，涡旋混匀15s，瞬时离心收集后将管置于磁力架，静置至溶液澄清后，弃上清，重复一次。短暂离心，将离心管置于磁力架上，小心吸尽上清，空气干燥10min至磁珠表面无反光。加入50ulEB，涡旋混匀，静置5min后，将管置于磁力架，静置至溶液澄清后，收集上清游离DNA溶液。
[0031]S
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2.构建DNA文库。
[0032]使用Twist试剂盒进行如下工作，打断DNA、进行末端修复和加A尾：将50ng DNA样品，放入Fragmentation Buffer和Fragmentation Enzyme的混合液，放入PCR仪中，分别在32℃放22分钟，65℃放30分钟，4℃保存。加入通用接头：将预先混合的接头液(由水，DNA Ligation Buffer，DNA Ligation Mix和Univer本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测肠癌基因的靶向药位点的探针组合，其特征在于，包含有针对22个基因的探针，所述22个基因为：AKT1基因、ALK基因、BRAF基因、ERBB2基因、ERBB4基因、FBXW7基因、KRAS基因、MAP2K1基因、MET基因、PTEN基因、SMAD4基因、STK11基因、CTNNB1基因、DDR2基因、EGFR基因、FGFR1基因、FGFR2基因、FGFR3基因、NOTCH1基因、NRAS基因、PIK3CA基因、TP53基因。2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述探针的具体序列如下：AKT1基因的探针序列如SEQ No.1～SEQ No.3所示、ALK基因的探针序列如SEQ No.4～SEQ No.6所示、BRAF基因的探针序列如SEQ No.7～SEQ No.9所示、ERBB2基因的探针序列如SEQ No.10～SEQ No.12所示、ERBB4基因的探针序列如SEQ No.13～SEQ No.15所示、FBXW7基因的探针序列如SEQ No.16～SEQ No.18所示、KRAS基因的探针序列如SEQ No.19～SEQ No.21所示、MAP2K1基因的探针序列如SEQ No.22～SEQ No.24所示、MET基因的探针序列如SEQ No.25～SEQ No.27所示、PTEN基因的探针序列如SEQ No.28～SEQ No.30所示、SMAD4基因的探针序列如SEQ No.31～SEQ No.33所示、STK11基因的探针序列如SEQ No.34～SEQ No.36所示、CTNNB1基因的探针序列如SEQ No.37～SEQ No.39所示、DDR2基因的探针序列如SEQ No.40～SEQ No.42所示、EGFR基因的探针序列如SEQ No.43～SEQ No.45所示、FGFR1基因的探针序列如SEQ No.46～SEQ No.48所示、FGFR2基因的探针序列如SEQ No.49～SEQ No.51所示、FGFR3基因的探针序列如SEQ No.52～SEQ No.54所示、NOTCH1基因的探针序列如SEQ No.55～SEQ No.57所示、NRAS基因的探针序列如SEQ No.58～SEQ No.60所示、PIK3CA基因的探针序列如SEQ No.61～SEQ No.63所示、TP53基因的探针序列如SEQ No.64～SEQ No.66所示。3.一种检测肠癌基因靶向药位点的试剂盒，包含有权利要求1或者2的探针组合。4.一种非诊断治疗目的的肠癌基因靶向药位点的检测方法，其特征在于：...
【专利技术属性】
技术研发人员：詹东亮，
申请(专利权)人：南京艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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