一种检测NPM1突变分型的方法及其引物和探针技术

本发明专利技术公开一种检测NPM1突变分型的方法及其引物和探针，所述引物

【技术实现步骤摘要】
一种检测NPM1突变分型的方法及其引物和探针


[0001]本专利技术涉及基因突变检测
，具体涉及一种检测NPM1突变分型的方法及其引物和探针。

技术介绍

[0002]NPM1是一种编码具有伴侣和穿梭功能的多功能核仁蛋白的基因，30％的成人急性髓系白血病(AML)患者携带NPM1突变，表现出独特的分子和临床病理特征。NPM1基因外显子12的突变是正常核型AML患者中最特异和最常见的遗传病变。NPM1突变导致其蛋白C端改变，这是其细胞质异常的原因。经修订的2017年世界卫生组织(WHO)子分类中，NPM1突变型AML被视为AML的一个独特亚型。
[0003]迄今为止，已鉴定出约40个杂合NPM1突变。成人病例中，75％以上的病例是由于TCTG重复而导致A突变，另有15
‑
20％的病例是由于CATG或CCTG四核苷酸插入而导致B或D突变。大量证据表明，人类白血病微小残留病(MRD)与临床结局显著相关，因此MRD监测对临床决策至关重要。MRD正确评估在NPM1突变AML的复发风险方面也起着重要作用。
[0004]目前，检测NPM1突变的主要检测方法包括一代测序法、定量PCR、变性高效液相色谱法(dHPLC)和基因表达谱等。一代测序是核酸检测的金标准，但检测过程时间长，检测灵敏度低，检测下限仅为20％，且不能定量；变性高效液相色谱法(dHPLC)和基因表达谱由于操作繁琐和技术问题，还没有在临床应用中推广。荧光定量PCR由于其敏感性高，检测周期短及成本低等优点，在临床上得到广泛的应用。但是目前的PCR检测方法在检测NPM1 A、B、D突变分型时，针对各种分型分别设计引物和探针，容易产生操作误差和增加交叉差污染的几率。。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种检测NPM1突变分型的方法及其引物和探针。本专利技术通过利用NPM1突变的RNA序列特征，开发了高灵敏度、特异、可靠的RNA实时定量PCR检测方法，能够监测NPM1的A型、B型和D型三种常见突变。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种检测NPM1突变分型的引物
‑
探针组合，所述引物
‑
探针组合包括：
[0008]共用上游引物，其序列为TGTGAAGAATTGCTTCCGG(SEQ ID NO.1)；
[0009]A型下游引物，其序列为TTCTCCTCCACTGCCA(SEQ ID NO.2)；
[0010]B型下游引物，其序列为GACTTCCTCCACTGCC(SEQ ID NO.3)；
[0011]D型下游引物，其序列为TTCCTCCACTGCCAG(SEQ ID NO.4)；
[0012]共用探针，其序列为5
’‑
FAM
‑
TGACCAAGAGGCTATTCA
‑
MGB
‑3’
(SEQ ID NO.5)。
[0013]本专利技术的第二方面，提供引物
‑
探针组合在制备检测NPM1突变分型的试剂和/或试剂盒中的用途。
[0014]本专利技术的第三方面，提供一种检测NPM1突变分型的试剂盒，所述试剂盒中含有上述引物
‑
探针组合。
[0015]优选的，所述试剂盒中还包括：RT Mix、HiScript II Enzyme Mix、Oligo(dT)、AceQ U+Probe Master Mix、ROX参比染料和ddH2O。
[0016]优选的，所述RT Mix为5～15μL；所述HiScript II Enzyme Mix为1～3μL；所述Oligo(dT)为0.5～1.5μL；所述AceQ U+Probe Master Mix为5～15μL；所述ROX参比染料为0.4μL；所述RNase
‑
free ddH2O为2～4μL。
[0017]优选的，所述试剂盒中还包括：A型、B型和D型突变质粒参考品。
[0018]优选的，A型下游引物、B型下游引物或D型下游引物分别和共用上游引物、共用探针预先包被于一个PCR反应管内。
[0019]本专利技术的第四方面，提供试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0020]采用试剂盒构建PCR扩增体系，以待测样本的RNA为模板，利用突变质粒参考品定量出待测样本的突变拷贝数，确定NPM1突变分型。
[0021]优选的，所述逆转录体系包括：
[0022]RT Mix 10μL、HiScript II Enzyme Mix 2μL、Oligo(dT)1μL；
[0023]所述突变型扩增体系包括：
[0024]AceQ U+Probe Master Mix 10μL、ROX 0.4μL、上游引物0.6μL、A3下游共用引物0.6μL、共用探针0.4μL。
[0025]优选的，所述逆转录的条件为：25℃5min；50℃15min；85℃2min；
[0026]所述PCR扩增的条件为：95℃5min；95℃15s，62℃1min，40个循环。
[0027]本专利技术的有益效果：
[0028](1)本专利技术的试剂盒进一步提高了NPM1突变检测敏感性，缩短了检测时长，最低检测限可达到100copies/μl。
[0029](2)本专利技术的试剂盒可以对NPM1突变进行定量检测，线性范围宽。特别是在拷贝数为100copies/μl，仍具有很好的线性范围。
[0030](3)本专利技术的检测过程为闭管操作，可以避免污染；同时，已经利用临床阴阳性样本验证，特异性好，灵敏度高，稳定性强，仪器设备也无特殊要求，适合临床广泛开展。
[0031](4)本专利技术实现了在检测NPM1突变的RNA序列特征中共用上游引物及共用探针检测A、B、D三种NPM1突变分型，并可以保障目标序列的扩增完整性，有效识别突变序列，同时可以减少工作量，降低操作误差和交叉差污染的几率。
附图说明
[0032]图1：A型阳性样本扩增曲线；
[0033]图2：B型和D型阳性样本扩增曲线；
[0034]图3：阴性样本扩增曲线；
[0035]图4：A型突变参考品扩增曲线和线性；
[0036]图5：B型突变参考品扩增曲线和线性；
[0037]图6：D型突变参考品扩增曲线和线性；
[0038]图7：重复不精密度—A型检测孔扩增曲线；
[0039]图8：重复不精密度—B型检测孔扩增曲线；
[0040]图9：重复不精密度—D型检测孔扩增曲线；
[0041]图10：A型线性曲线检测；
[0042]图11：B型线性曲线检测；
[0043]图12：D型线性曲线检测；
[0044]图13：A型下游引物
‑
1在阴性样本中的扩增曲线。
具体实施方式
[004本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测NPM1突变分型的引物
‑
探针组合，其特征在于，所述引物
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探针组合包括：共用上游引物，其序列为TGTGAAGAATTGCTTCCGG(SEQ ID NO.1)；A型下游引物，其序列为TTCTCCTCCACTGCCA(SEQ ID NO.2)；B型下游引物，其序列为GACTTCCTCCACTGCC(SEQ ID NO.3)；D型下游引物，其序列为TTCCTCCACTGCCAG(SEQ ID NO.4)；共用探针，其序列为5
’‑
FAM
‑
TGACCAAGAGGCTATTCA
‑
MGB
‑3’
(SEQ ID NO.5)。2.权利要求1所述的引物
‑
探针组合在制备检测NPM1突变分型的试剂和/或试剂盒中的用途。3.一种检测NPM1突变分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物
‑
探针组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：RT Mix、HiScript II Enzyme Mix、Oligo(dT)、AceQ U+Probe Master Mix、ROX参比染料和RNase
‑
free ddH2O。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT Mix为5～15μL；所述HiScrip...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁德波，张陈祎，王佳佳，王青，
申请(专利权)人：济南金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：