一种用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测TMPRSS2

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器及其应用


[0001]本专利技术属于传感器
，具体涉及一种用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器及其应用。

技术介绍

[0002]前列腺癌是全球范围内发病率排名第二，死亡率排名第五的男性肿瘤。尽管前列腺癌进展缓慢，但由于其发病隐匿、症状轻微导致死亡率还是居高不下。为了降低前列腺癌病人的死亡率，目前的主要方法就是以直肠指诊(DRE)与血清前列腺特异抗原(PSA)检测为代表的早期筛查。尽管从PSA检测应用于临床以来，大规模的血清PSA可以在早期阶段检测出更多的前列腺癌病人。但由于PSA特异性相对较低，因此在进行大规模前列腺癌筛查时会给很多非前列腺癌的病人带来不必要的活检与过度的检查。出于对前列腺癌过度诊疗的担忧，美国预防服务工作组在2012年将PSA筛查的推荐等级调整为D级别，也即是反对在成年男性人群中开展饱和PSA筛查。因此寻找灵敏性、特异性更高的前列腺癌肿瘤标志物迫在眉睫。
[0003]研究发现，有些前列腺癌病人做完DRE检查后可以在其尿液中检测到一种肿瘤特异性非常高的融合基因。这个融合基因是由TMPRSS2基因的第一个外显子与ERG基因第四个外显子融合组成，称为TMPRSS2:ERG融合基因。根据Scott A.Tomlins等人研究发现，TMPRSS2:ERG融合基因对于前列腺癌的诊断具有高特异性、相对低灵敏性的特点，可以联合其他标志物一起检测。因此，TMPRSS2:ERG融合基因是一个非常有潜力的前列腺癌诊断标志物。目前对于TMPRSS2:ERG基因的检测，主要是提取病人DRE术后尿液中的总RNA，并进行RT
‑
qPCR定量分析。尽管RT
‑
qPCR实验具有优秀的定量分析能力，但是其需要专业的人员对大型仪器进行长时间的专业操作。不利于在条件相对简陋的环境下进行检测，这也是TMPRSS2:ERG基因一直未能广泛应用于前列腺癌筛查的主要原因之一。为了提高基因检测的效率，使基因检测可以用于资源相对缺乏的地区，有团队研究出了可以用于即时检验(point
‑
of
‑
care testing,POCT)环境下的试纸条检测平台来代替大型仪器检测基因，这种试纸条的优势在于方便携带、结果展示直观、一次可以检测多个基因。但是其劣势也相对明显，比如构建试纸条的方法相对复杂、容易受到环境的干扰、难以进行定量检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器及其应用，该电化学传感器将基因检测、CRISPR技术与传感器结合，具有操作便捷、检测快速、准确的特点。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种用于检测TMPRSS2
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ERG融合基因的电化学传感器体系，包括TMPRSS2
‑
ERG融合基因恒温扩增体系试剂、CRISPR/Cas12试剂和金工作电极。
[0006]本申请专利技术人从改进TMPRSS2:ERG基因检测方法出发，采用成本更低、快速且灵敏的电化学传感器为检测平台，再通过RT
‑
RAA技术对TMPRSS2:ERG基因进行快速扩增、CRISPR
‑
Cas12a系统对扩增产物进行识别，通过简化检测方法，降低对大型仪器与专业平台的依赖，缩短检测的时间，以及更直观的表示检测结果。本专利技术的电化学传感器体系将TMPRSS2:ERG基因的检测应用于前列腺癌筛查，有着广阔的应用前景和产业化前景。
[0007]作为本专利技术所述的用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述TMPRSS2
‑
ERG融合基因恒温扩增体系试剂包括TMPRSS2
‑
ERG融合基因恒温扩增引物；所述恒温扩增体系试剂的恒温扩增方法选自重组酶介导恒温核酸扩增、环介导恒温扩增和超分支滚环扩增恒温扩增方法中任一种；所述TMPRSS2
‑
ERG融合基因恒温扩增引物选择以下任意一对：
[0008]TE
‑1‑
F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:1)
[0009]TE
‑1‑
R：CCAGTCGTTGTTTGAGTGTGCCTAC(SEQ ID NO:2)
[0010]TE
‑2‑
F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:3)
[0011]TE
‑2‑
R：CTCCTCCAGCGACTATGGAC(SEQ ID NO:4)
[0012]TE
‑3‑
F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:5)
[0013]TE
‑3‑
R：GGAGTGGGCGGTGAAAGAATATGG(SEQ ID NO:6)
[0014]TE
‑4‑
F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:7)
[0015]TE
‑4‑
R：CTCACCCCCAGCTACAACGAA(SEQ ID NO:8)。
[0016]作为本专利技术所述的用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述CRISPR/Cas12试剂包括TMPRSS2:ERG基因的特异性crRNA引物和Cas12蛋白。所述CRISPR/Cas12a试剂合成的crRNA含有与所述恒温扩增产物结合的TTTN序列。
[0017]作为本专利技术所述的用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述TMPRSS2:ERG基因的特异性crRNA引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。本申请专利技术人经过大量的实验设计crRNA体外转录所需DNA模板的PCR扩增引物，其中上游引物包含有T7启动子区和21
‑
nt的固定序列，下游引物包含有19
‑
nt目的基因的互补序列以及21
‑
nt的固定序列。
[0018]作为本专利技术所述的用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述金工作电极为印刷电极，包括工作电极、参比电极和对电极；所述金电极含有SH
‑
ssDNA
‑
MB(5
’
端巯基修饰，3
’
端亚甲蓝MB修饰)；所述ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
[0019]作为本专利技术所述的用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器体系，其特征在于，包括TMPRSS2
‑
ERG融合基因恒温扩增体系试剂、CRISPR/Cas12a试剂和金工作电极。2.根据权利要求1所述的用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器体系，其特征在于，所述TMPRSS2
‑
ERG融合基因恒温扩增体系试剂包括TMPRSS2
‑
ERG融合基因恒温扩增引物；所述恒温扩增体系试剂的恒温扩增方法选自重组酶介导恒温核酸扩增、环介导恒温扩增和超分支滚环扩增恒温扩增方法中任一种；所述TMPRSS2
‑
ERG融合基因恒温扩增引物选择以下任意一对：TE
‑1‑
F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:1)TE
‑1‑
R：CCAGTCGTTGTTTGAGTGTGCCTAC(SEQ ID NO:2)TE
‑2‑
F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:3)TE
‑2‑
R：CTCCTCCAGCGACTATGGAC(SEQ ID NO:4)TE
‑3‑
F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:5)TE
‑3‑
R：GGAGTGGGCGGTGAAAGAATATGG(SEQ ID NO:6)TE
‑4‑
F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:7)TE
‑4‑
R：CTCACCCCCAGCTACAACGAA(SEQ ID NO:8)。3.根据权利要求1所述的用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器体系，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a试剂包括TMPRSS2:ERG基因的特异性crRNA引物和Cas12a蛋白；所述CRISPR/Cas12a试剂合成的crRNA含有与所述恒温扩增产物结合的TTTN序列。4.根据权利要求3所述的用于检测TMPRSS2
‑
ERG融合基因的电化学传感器体系，其特征在于，所述TMPRSS2:ERG基因的特异性crRNA引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾国华，黄锦坤，刘宏星，古迪，陈文哲，吴思丞，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：