本发明专利技术公开了一种装载靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子的外泌体、其制备方法及应用。所述外泌体包含靶向酪氨酸酶基因的siRNA或shRNA。该方法操作简单易行，工艺稳定，适用性好。所得外泌体中包载有大量靶向酪氨酸酶基因的siRNA或shRNA，可高效抑制酪氨酸激酶的合成，从而减少黑色素的形成，可以作为一种高效的药物传递系统应用医疗美容领域。的药物传递系统应用医疗美容领域。的药物传递系统应用医疗美容领域。
【技术实现步骤摘要】
一种装载靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子的外泌体、其制备方法及应用
[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种装载靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子的外泌体、其制备方法及应用。
技术介绍
[0002]人的皮肤颜色主要由基础表皮层中色素黑色素的含量决定。黑色素的产生多与内分泌失调、日光照射有关，黑色素细胞的多少主要取决于遗传，另外，还与内分泌激素及营养状况有关，由黑色素导致的疾病如:雀斑、黄褐斑、黑变病等，成为美容界研究的课题。
[0003]酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)是涉及人和小鼠黑素体细胞中黑色素合成的主要酶，其活性与毛发和皮肤色素沉着、色素沉着过度、老年斑和皮肤着色不均有关。
[0004]日常生活中我们一般通过使用美白化妆品例如美白面膜、精华、乳液、面霜等产品改善皮肤暗沉、色斑等肌肤问题。美白化妆品是由基质加上其它辅料如抗氧化剂、肪腐剂、香料、表面活性剂、美白成分、保湿剂、皮肤渗透剂等组成。但是，目前市售的美白化妆品经常会出现美白效果不佳、产品稳定性差(外观和质的变化)、产生副作用(用后皮肤变得更黑、生斑甚至加重)等问题。
[0005]小干扰RNA(siRNA)介导的基因沉默是用于研究哺乳动物细胞中基因功能的有力工具。基因沉默技术自问世以来，在各种疾病包括色素沉着等肌肤问题的治疗中得到广泛应用。US8119791B2公开了一种化妆品组合物，其包含一种或多种siRNA低聚物，能有效地改善、减少和/或消除皮肤色素沉着过度或其它不想要的皮肤色素沉着。CN105854028A公开了一种抑制酪氨酸酶表达的双链RNA寡核苷酸及其在抑制酪氨酸酶表达、预防形成和/或消除色素形成斑、老年斑、增亮和/或漂白褐色皮肤、使褐色皮肤颜色均匀中的用途。RNA药物虽然具有它的优越性性，但是RNA药物必须在胞内才能发挥作用。但RNA分子带负电荷，并且对体内广泛存在的核酸酶敏感。因此，RNA药物目前仍存在在胞内不能释放、引起体细胞炎症反应、使用慢病毒/逆转录病毒递送易引起基因突变等问题。
[0006]干细胞外泌体可用于美白。从理论机制上讲，干细胞外泌体能够实现抗皮肤老化的可能途径有促进角质形成细胞的迁移和增殖、促进成纤维细胞增殖、抑制基质金属蛋白酶(MMPs)活性和减少皮肤氧化应激反应。外泌体发挥生物学效应的方式主要有两种：一是直接作用，外泌体表面的蛋白分子或脂质配体直接激活靶细胞表面的受体，产生信号复合体并激活胞内信号通路；二是递送作用，外泌体可以与靶细胞的质膜融合或内吞直接进入细胞，将自身携带的蛋白质、核酸、脂质等活性分子带到细胞内，进而调控细胞的功能及生物学行为。
[0007]人体的所有核细胞都会分泌外泌体，干细胞外泌体是干细胞在体外培养过程中释放出来的，把细胞培养的上清液收集起来，通过高速离心的方式就能获得外泌体。干细胞来源的外泌体，具有降低细胞凋亡、缓解炎症、促进血管新生成，抑制纤维化、提升组织再生修复潜力等生物学功能，干细胞外泌体与干细胞疗法在体内发挥的作用一致，所以它在很大
程度上可以代替目前的干细胞治疗，同时，还可以避免干细胞治疗带来的安全性、稳定性、排异性问题，因此很多生物学家坚信外泌体是继干细胞技术之后又一个重要的再生医学发展方向。但是外泌体成分复杂，发挥作用的有效成分和作用机制不明确，生产工艺不稳定，极大的限制了外泌体在医美领域的应用。由于在皮肤屏障完整的情况下，直接涂抹外泌体很难穿过角质层进入皮肤，所以目前的外泌体使用方式一般为静脉注射。但是静脉注射的外泌体，大部分不能到达靶标部位(皮肤)，使用剂量高，半衰期短，安全性差，生产质控要求高，成本高。
[0008]因此，开发一种靶向TYR基因的siRNA或shRNA分子及递送该siRNA或shRNA分子药物的外泌体具有重要意义。
技术实现思路
[0009]本专利技术为了克服现有技术的不足，提供一种装载靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子的外泌体、其制备方法及应用。
[0010]本专利技术提供的技术方案如下：
[0011]本专利技术的第一方面，提供了一种装载靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子的外泌体。
[0012]所述靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子选自siRNA、shRNA、反义寡核苷酸药物、三链核酸、CpG寡核苷酸、Aptamer、microRNA中的一种或多种；
[0013]进一步，所述靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子是siRNA或shRNA。
[0014]进一步，所述外泌体包含靶向酪氨酸酶基因的siRNA，所述靶向酪氨酸酶基因的siRNA的序列如SEQ NO:1
‑
SEQ NO:6所示；
[0015]更进一步，所述靶向酪氨酸酶基因的siRNA的序列如SEQ NO:4、SEQ NO:5所示。
[0016]本专利技术中靶向酪氨酸酶基因的siRNA还可以替换为黑色素细胞增殖抑制相关siRNA或黑色素细胞凋亡促进相关siRNA。
[0017]进一步，所述外泌体包含靶向酪氨酸酶基因的shRNA，所述靶向酪氨酸酶基因的shRNA的序列如SEQ NO:7
‑
SEQ NO:12所示。
[0018]本专利技术的第二方面，提供了一种本专利技术第一方面所述的外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0019](1)设计合成可以有效沉默酪氨酸酶基因的siRNA，并感染细胞验证其效果；
[0020](2)根据步骤(1)中的siRNA序列设计shRNA序列；
[0021](3)将步骤(2)中得到的shRNA序列克隆至质粒表达载体，得到shRNA表达载体；
[0022](4)将步骤(3)中得到的shRNA表达载体用慢病毒进行包装，得到shRNA慢病毒表达载体；
[0023](5)用步骤(4)中得到的shRNA慢病毒表达载体感染间充质干细胞，收集阳性细胞培养液；
[0024](6)从步骤(5)得到的阳性细胞培养液中提取外泌体。
[0025]进一步，步骤(2)中所述质粒表达载体为pLKO.1
‑
puro质粒。
[0026]进一步，步骤(5)中所述间充质干细胞选自以下其中一种：脂肪来源间充质干细胞、脐带来源的间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、牙髓来源间充质干细胞、诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞。
[0027]进一步，步骤(6)中采用总外泌体分离试剂提取外泌体。
[0028]本专利技术的第三方面，提供了本专利技术第一方面所述的外泌体或本专利技术第二方面所述的制备方法制得的外泌体在制备用于抑制黑色素生成的药物、化妆品或水光针中的应用。
[0029]进一步，通过所述水光针将所述外泌体导入表皮深层和真皮层。
[0030]此外，所述应用还可以通过微针、滚针的方式将所述外泌体导入表皮深层和真皮层。
[0031]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0032](1)本专利技术提供了一种装载shRNA的外泌体，该外泌体中包载有大量靶向酪氨酸酶基因的shRNA，外泌体能通过膜融合的方式将shRNA释放到本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种装载靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子的外泌体，其特征在于，所述靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子选自siRNA、shRNA、反义寡核苷酸药物、三链核酸、CpG寡核苷酸、Aptamer、microRNA中的一种或多种；优选地，所述靶向酪氨酸酶基因的小核酸分子是siRNA或shRNA。2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体包含靶向酪氨酸酶基因的siRNA，所述靶向酪氨酸酶基因的siRNA的序列如SEQ NO:1
‑
SEQNO:6所示；优选地，所述靶向酪氨酸酶基因的siRNA的序列如SEQ NO:4、SEQ NO:5所示。3.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体包含靶向酪氨酸酶基因的shRNA，所述靶向酪氨酸酶基因的shRNA的序列如SEQ NO:7
‑
SEQ NO:12所示。4.权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计合成可以有效沉默酪氨酸酶基因的siRNA，并感染细胞验证其效果；(2)根据步骤(1)中的siRNA序列设计shRNA序列；(3)将步骤(2)中得到的shRNA序列克隆至质...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏洪波，王天怡，姜海涛，那路新，夏熒辛，
申请(专利权)人：夏洪波，
类型：发明
国别省市：
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