适用于停滞棒杆菌的启动子及应用制造技术

本发明专利技术提供了适用于停滞棒杆菌的启动子及应用。适用于停滞棒杆菌的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示。本发明专利技术通过将启动子导入至棒杆菌内，实现停滞棒杆菌目的蛋白的高水平表达，克服了现有启动子强度低、棒状细菌中代谢物、蛋白表达难、表达效率低的问题，从而达到进一步提高目的蛋白合成的目的，实现了比现有棒杆菌Psod启动子高2.63倍与2.36倍的GFP蛋白及α

【技术实现步骤摘要】
适用于停滞棒杆菌的启动子及应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及适用于停滞棒杆菌的启动子及应用。

技术介绍

[0002]基因表达是指基因经过转录、翻译等，产生有生物活性的RNA或蛋白，表现出其储存的遗传信息的过程，受多个水平不同因素的调控。无论在真核生物体内还是在原核生物体内，大多数的调控事件发生在转录水平。转录不仅是基因表达的第一步，还是控制基因活动的关键步骤；而启动子是转录水平调控的重要参与者。
[0003]启动子(Promoters)是RNA聚合酶识别、结合开始转录启动的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游。这样的启动子本身不被转录，但有一些启动子(如tRNA启动子)位于转录起始点的下游，这些DNA序列也可以被转录。启动子的活性受到多种因素的影响，而在基因的异源表达中，常常需要根据实际需求选择不同活性的启动子
[0004]棒状杆菌属微生物是一类重要的细菌属，很多的棒状细菌作为工业生产模式菌株，很多被作为蛋白与优良代谢产物生产的宿主，目前实现了多种蛋白、氨基酸、代谢物等的高效生产，然而，依旧存在在棒状杆菌中代谢物、蛋白表达难、表达效率低的问题。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供适用于停滞棒杆菌的启动子，以解决现有技术中的棒状杆菌中代谢物、蛋白表达难、表达效率低的问题。
[0006]本专利技术的目的是提供适用于停滞棒杆菌的启动子，所述的启动子序列为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中的任意一个。
[0007]适用于停滞棒杆菌的启动子在高效表达目的蛋白中的应用，将本专利技术的启动子导入停滞棒杆菌中，可提高停滞棒杆菌生产目的蛋白的能力。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0009]为得到适用于停滞棒杆菌的启动子，构建启动子文库，所述启动子文库模板核心区域
‑
35、
‑
10来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13032丙酮酸羧化酶(Pyc)启动子序列，其启动子核心序列如下所示：
[0010]NNNNNNTTGATTNNNNNNNNNNNNNNNTANNATNNNNNN
[0011]适用于停滞棒杆菌的启动子，所述的启动子序列为SEQ ID NO：5所示；或SEQIDN：6所示；或SEQ ID NO：7所示：
[0012]SEQ ID NO.5：
[0013]AACCGGTTGATTTAAAGATCCTTAGGATATCATTCAATT；
[0014]SEQ ID NO.6：
[0015]TGAAAATTGATTTAAACTTGGGCATGTTAAGATAAGTGG；
[0016]SEQ ID NO.7：
[0017]AGATTATTGATTTTCCGTGTTAGCCGTTATCATAGTAGC；
[0018]适用于停滞棒杆菌的启动子在提高停滞棒杆菌目的蛋白表达量中的应用，将本专利技术提供的启动子，导入地衣芽孢杆菌中，可提高蛋白表达；将所述的启动子启动目的基因的表达可提高蛋白表达量。
[0019]以上所述的应用中，优选的，所述目的蛋白为绿色荧光蛋白和α
‑
淀粉酶；
[0020]以上所述的应用中，优选的，所述停滞棒杆菌为停滞棒杆菌ATCC6872。
[0021]以上实施例所提供的适用于停滞棒杆菌的启动子及其在高效表达目的产物的应用具有以下有益效果：
[0022]1、本专利技术通过将启动子导入至棒杆菌内，实现停滞棒杆菌目的蛋白的高水平表达，克服了现有启动子强度低、棒状细菌中代谢物、蛋白表达难、表达效率低的问题，从而达到进一步提高目的蛋白合成的目的，实现了比现有棒杆菌Psod启动子高2.63倍与2.36倍的GFP蛋白及α
‑
淀粉酶表达水平。
[0023]2、通过确定所述启动子的核心区的
‑
35区(6bp)、
‑
10区(6bp)、核心间隔区(15
‑
18bp)，从而挑选出全新的具有表达功能的启动子，运用于停滞棒杆菌基因表达与目的蛋白产生中，进一步使启动子介导表达的基因在整个发酵周期都能有效表达，而且所用的启动子核心区域来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13032丙酮酸羧化酶(Pyc)启动子序列，因此所述启动子能受谷氨酸棒杆菌中σ因子识别的结构域，从而实现导入的启动子可以提高停滞棒状杆菌目的蛋白的产量。
[0024]3、在构建启动子文库中，在保证启动子核心区固定情况下人工的为启动子两端设计添加BsaⅠ酶切位点及延伸保护序列组成启动子模板，在启动子两端设计添加BsaⅠ酶切位点不仅灵活实用，适合于构建所有简单和复杂的表达载体，而且后续载体构建工作快捷、高效，加快了对本专利技术启动子对停滞棒杆菌目的蛋白产量水平的研究。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0026]图1为在SEQ ID NO：5
‑
7启动子调控下，对GFP分泌表达影响示意图；
[0027]图2为在SEQ ID NO：5
‑
7启动子调控下，对α
‑
淀粉酶分泌表达影响示意图。
具体实施方式
[0028]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]需要说明，若本专利技术实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后
……
)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
[0030]另外，若本专利技术实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，若全文中出现的“和/或”或者“及/或”，其含义包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本专利技术要求的保护范围之内。
[0031]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.适用于停滞棒杆菌的启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。2.如权利要求1所述的适用于停滞棒杆菌的启动子，其特征在于，其核苷酸序列还如SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示。3.如权利要求1
‑
2任意一项所述的启动子在提高停滞棒杆菌目的蛋白表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡友华，林钰宽，叶光正，张翀，吴子豪，余心宇，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：