一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株技术

本发明专利技术涉及一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株，属于基因工程技术领域。本发明专利技术涉及一种褐藻酸裂解酶突变体，包括褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA

【技术实现步骤摘要】
一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株。

技术介绍

[0002]褐藻酸是一种主要由褐藻以及细菌产生的线性酸性多糖，是褐藻门植物如海带、裙带菜等细胞壁的主要成分。主要由两种单体，β
‑
D
‑
甘露糖醛酸(M)和α
‑
L
‑
古罗糖醛酸(G)组成。各个单体之间通过1
→
4糖苷键相连，可在褐藻酸中形成三个不同的嵌段：均聚甘露糖醛酸片段(polyM)、均聚古罗糖醛酸片段(polyG)、以及由两个单体交替连接形成杂合片段(polyMG)。
[0003]褐藻酸因聚合度高、分子量大、粘度高等很难被机体吸收利用，限制了其应用。褐藻酸寡糖(AOs)是褐藻酸的降解产物，具有显著的生理活性，如免疫调节、抗菌、抗氧化、益生元、抗高血压、抗糖尿病、抗肿瘤和抗凝血活性等。同时AOs可加速微生物代谢、促进根的生长、提高植物的产量和质量、提高植物的抗病性、诱导植物免疫性，可用于制备生物肥料。
[0004]现在制备AOs的方法主要包括物理降解法、化学法和酶法。与物理和化学方法相比，酶法生产AOs更环保、更节能、可持续发展潜力大。目前褐藻酸裂解酶已成为研究的热点。褐藻胶酸裂解酶属于多糖裂解酶家族(polysaccharidelyasefamily，PLs)，可通过β
‑
消除来降解褐藻酸产生AOs。然而褐藻酸裂解酶在生产AOs时需要经过高温处理环节，这样导致酶活大大降低。因此需要开发一种热稳定性优良的褐藻酸裂解酶来满足市场的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种褐藻酸裂解酶突变体，包括褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K或褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D；
[0008]所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0009]编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0010]所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
[0011]编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0012]本专利技术还提供了一种所述褐藻酸裂解酶突变体的制备方法，所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K；
[0013]所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D。
[0014]作为优选，所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸为组氨酸；
[0015]所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的第71位氨基酸为赖氨酸；
[0016]所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸为组氨酸；
[0017]所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的第176位氨基酸为天冬氨酸。
[0018]本专利技术还提供了一种重组表达载体，包括编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K或FlAlyA
‑
H176D的核苷酸序列以及空载载体pET22b(+)。
[0019]本专利技术还提供了所述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：将编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K或FlAlyA
‑
H176D的核苷酸序列与pET22b(+)连接，得到重组表达载体；
[0020]所述连接的位点为限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切后的位点。
[0021]本专利技术还提供了一种重组表达菌株，包括所述重组表达载体以及出发菌株；
[0022]所述出发菌株为大肠杆菌BL21
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CodonPlus
‑
RIL。
[0023]本专利技术还提供了所述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：将所述的重组表达载体导入出发菌株中，诱导表达得到重组表达菌株。
[0024]作为优选，所述诱导的诱导剂为异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)；
[0025]所述异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷的终浓度为0.1mM；
[0026]所述诱导的温度为23～27℃；
[0027]所述诱导的时间为22～26h。
[0028]本专利技术还提供了所述褐藻酸裂解酶突变体在制备热稳定性高的产品方面的应用。
[0029]本专利技术还提供了所述重组表达载体或所述重组表达菌株在制备热稳定性高的产品方面的应用。
[0030]本专利技术提供了一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株。
[0031]本专利技术的褐藻酸裂解酶突变体具有热稳定性高，产量高的特性，可以进行工业生产。
[0032]本专利技术提供的褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的酶活可达到1.11
×
105U/mg，最适pH8.0，在pH 7.0～9.0条件下具有80％以上的酶活力，具有良好的pH稳定性；最适温度50℃，且在40
‑
55℃时酶活力仍保留80％以上。与野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA相比，ΔT
m
为0.33℃。褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的酶活可达到0.95
×
105U/mg，最适温度50℃，最适pH8.0；与野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA相比，ΔT
m
为1.26℃且在50℃时的半衰期显著延长，表明其热稳定性提高。此外，1L发酵液可获得600
±
50mg FlAlyA
‑
H71K和FlAlyA
‑
H176D纯酶，远高于现有水平，为褐藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能。
附图说明
[0033]图1为野生型褐藻酸裂解酶和褐藻酸裂解酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种褐藻酸裂解酶突变体，其特征在于，包括褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K或褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；编码所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.一种权利要求1所述褐藻酸裂解酶突变体的制备方法，其特征在于，所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的制备方法为：将褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸进行突变得到褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第71位氨基酸为组氨酸；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H71K的第71位氨基酸为赖氨酸；所述褐藻酸裂解酶FlAlyA的第176位氨基酸为组氨酸；所述褐藻酸裂解酶突变体FlAlyA
‑
H176D的第17...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨登峰，张秀，潘丽霞，李红亮，阳丽艳，黄艳冰，李娟，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：