用于核酸测序的方法、系统和组合物技术方案

本公开涉及用于核酸测序应用的方法、系统、试剂盒和组合物。具体地，该方法利用具有不同激发波长的两个成像事件和单个发射通道来收集不同类型的核苷酸缀合物的荧光信号模式以确定掺入的核苷酸缀合物的同一性。本文所述的方法不需要在该两个成像事件之间对掺入混合物中的核苷酸缀合物的化学处理。合物中的核苷酸缀合物的化学处理。合物中的核苷酸缀合物的化学处理。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸测序的方法、系统和组合物


[0001]本公开一般涉及用于核酸测序应用的方法、系统、试剂盒和组合物。

技术介绍

[0002]核酸测序方法已从Maxam和Gilbert所使用的化学降解方法以及Sanger所使用的链延长方法得到了显著发展。现今使用了允许在单个测序运行中并行处理数千个核酸的若干测序方法。执行此类方法的仪器通常是大型且昂贵的，因为当前方法通常依赖于大量昂贵的试剂和多组光学滤光器以记录核酸掺入到测序反应中。
[0003]已经清楚的是，对高通量、较小型、较便宜的DNA测序技术的需求将有利于获得基因组测序带来的回报。个性化保健越来越前沿，并且将受益于此类技术。对个体的基因组进行测序以识别潜在的突变和异常，对于鉴别一个人是否患有特定疾病并在随后针对该个体定制后续疗法将是至关重要的。为了适应此类努力，测序技术不仅应该具有高通量能力，而且应该具有可扩展性。因此，现在需要在速度、错误读取和成本效益均有改进的新的测序方法。

技术实现思路

[0004]本公开提供新一代测序方法、系统和组合物。本公开的一些实施方案涉及一种用于确定靶多核苷酸的序列的方法，该方法包括：
[0005](a)使引物多核苷酸与包含四种不同类型的核苷酸缀合物中的一种或多种类型的核苷酸缀合物的混合物(即，掺入混合物)接触，其中第一类型的核苷酸缀合物包含第一标记，第二类型的核苷酸缀合物包含第二标记，并且第三类型的核苷酸缀合物包含第三标记，其中第一标记、第二标记和第三标记中的每一者在光谱上彼此不同，并且其中引物多核苷酸与靶多核苷酸的至少一部分互补；
[0006](b)使来自混合物的核苷酸缀合物掺入引物多核苷酸中以产生延伸的引物多核苷酸；
[0007](c)使用第一激发光源执行第一成像事件并且收集来自延伸的引物多核苷酸的第一发射信号；以及
[0008](d)使用第二激发光源执行第二成像事件并且收集来自延伸的引物多核苷酸的第二发射信号；
[0009]其中第一激发光源和第二激发光源具有不同波长；并且其中第一发射信号和第二发射信号在单个发射检测通道/滤光器中检测或收集。在一些实施方案中，该方法不包括在第一成像事件之后并且在第二成像事件之前对混合物中的任何核苷酸缀合物的化学修饰。在一些实施方案中，混合物还包含第四类型的核苷酸缀合物，其中第四类型的核苷酸缀合物是未标记的或是用荧光部分标记的，该荧光部分不从第一成像事件或第二成像事件发出信号。在一些另外的实施方案中，掺入混合物中的四种不同类型的核苷酸缀合物中的一种或多种类型的核苷酸缀合物中的每一者含有3'羟基封端基团。
[0010]在本文所述的测序方法中，基于第一成像事件和第二成像事件的检测模式来确定每种掺入的核苷酸缀合物的同一性。例如，第一类型的核苷酸缀合物的掺入由第一成像事件中的信号态和第二成像事件中的暗态来确定。第二类型的核苷酸缀合物的掺入由第一成像事件中的暗态和第二成像事件中的信号态来确定。第三类型的核苷酸缀合物的掺入由第一成像事件和第二成像事件两者中的信号态来确定。第四类型的核苷酸缀合物的掺入由第一成像事件和第二成像事件两者中的暗态来确定。在一些实施方案中，步骤(a)中的混合物包含四种不同类型的核苷酸缀合物(A、C、G和T或U)。在一些另外的实施方案中，四种类型的核苷酸缀合物中的三种类型的核苷酸缀合物各自用荧光团(在光谱上与另一个荧光团不同)标记，并且核苷酸中的一种核苷酸未用荧光团标记。在另外的实施方案中，步骤(a)到步骤(d)在重复循环(例如，至少30、50、100、150、200、250或300次)中执行，并且该方法还包括依次确定每种掺入的核苷酸缀合物的同一性，从而确定单链多核苷酸的至少一部分的序列。
[0011]本公开的附加的实施方案涉及一种用于测序应用的试剂盒，该试剂盒包含：
[0012]含第一标记的第一类型的核苷酸缀合物；
[0013]含第二标记的第二类型的核苷酸缀合物；以及
[0014]含第三标记的第三类型的核苷酸缀合物；
[0015]其中第一标记、第二标记和第三标记中的每一者在光谱上彼此不同，第一标记和第三标记能够使用第一光源波长激发，第二标记和第三标记能够使用不同于该第一光源波长的第二光源波长激发；并且其中第一标记、第二标记和第三标记中的每一者具有能够在单个检测通道中检测的发射光谱。在一些实施方案中，试剂盒包含四种不同类型的核苷酸缀合物(A、C、G和T或U)。在一些另外的实施方案中，四种类型的核苷酸缀合物中的三种类型的核苷酸缀合物各自用荧光团(在光谱上与另一个荧光团不同)标记，并且核苷酸中的一种核苷酸未用荧光团标记。
附图说明
[0016]图1A示出针对标准Illumina单通道合成测序(SBS)化学的流程图。
[0017]图1B示出来自标准单通道SBS的图像1和图像2如何由图像分析软件处理，以识别结合掺入了哪些碱基。
[0018]图2示出本文所述的测序方法的实施方案。
[0019]图3A示出用于本文所述的测序方法的检测系统的实施方案。
[0020]图3B示出本文所述的单个发射检测通道的实施方案。
[0021]图4示出根据本文所述的测序方法的实施方案在iSeq
TM
100系统上获得的散点图。
具体实施方式
[0022]Illumina的新一代测序系统iSeq
TM
100使用基于互补金属氧化物半导体(CMOS)的技术来实现简化的、易得到的台式测序解决方案。标准测序工作流如图1A和图1B所示，也称为单通道测序。每个测序循环包括两个化学步骤和两个成像步骤。在图1A中，第一化学步骤将流通池暴露于具有荧光标记的腺嘌呤和胸腺嘧啶的核苷酸的混合物。在第一成像步骤期间，由CMOS传感器记录来自每个簇的光发射。第二化学步骤从腺嘌呤中去除荧光标记并将
荧光标记添加到胞嘧啶。在两个化学步骤中，鸟嘌呤是暗的(未标记)。记录第二图像。在图1B中，图像1和图像2的组合由图像分析软件处理以识别在每个簇位置处掺入哪些碱基。此测序循环重复“n”次以创建“n”个碱基的读段长度。与四通道SBS化学不同，其中测序仪针对每种核苷酸使用不同的染料，iSeq
TM
100系统每个测序循环使用一种染料。在单通道化学中，腺嘌呤具有能够去除的标记并且仅在第一图像中进行标记。胞嘧啶具有可以结合标记并且仅在第二图像中进行标记的连接基基团。胸腺嘧啶具有持久荧光标记，并且因此在两个图像中进行标记，并且鸟嘌呤是永久暗的。核苷酸通过跨两个图像分析每个碱基的不同发射模式来识别。
[0023]本公开提供Illumina的iSeq
TM
100平台中描述的单通道测序的替代性和具有改善的解决方案。具体地，本公开提供用于使用两个成像步骤和一个发射检测滤光器/通道来确定核苷酸的掺入的同一性的方法。使用较少的滤光器允许在较小的占有面积上执行测序。此外，本公开的方法消除上述第二化学步骤。如本文所述的方法和系统降低器械硬件需求、减少器械的尺寸、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定靶多核苷酸的序列的方法，所述方法包括：(a)使引物多核苷酸与包含四种不同类型的核苷酸缀合物中的一种或多种类型的核苷酸缀合物的混合物接触，其中第一类型的核苷酸缀合物包含第一标记，第二类型的核苷酸缀合物包含第二标记，并且第三类型的核苷酸缀合物包含第三标记，其中所述第一标记、所述第二标记和所述第三标记中的每一者在光谱上彼此不同，并且其中所述引物多核苷酸与所述靶多核苷酸的至少一部分互补；(b)使来自所述混合物的核苷酸缀合物掺入所述引物多核苷酸中以产生延伸的引物多核苷酸；(c)使用第一激发光源执行第一成像事件并且收集来自所述延伸的引物多核苷酸的第一发射信号；(d)使用第二激发光源执行第二成像事件并且收集来自所述延伸的引物多核苷酸的第二发射信号；其中所述第一激发光源和所述第二激发光源具有不同波长；并且其中所述第一发射信号和所述第二发射信号在单个发射检测通道中收集。2.根据权利要求1所述的方法，其中第四类型的核苷酸缀合物是未标记的或是用荧光部分标记的，所述荧光部分不从所述第一成像事件或所述第二成像事件发出可检测的信号。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一类型的核苷酸缀合物的所述掺入由所述第一成像事件中的信号态和所述第二成像事件中的暗态来确定。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第二类型的核苷酸缀合物的所述掺入由所述第一成像事件中的暗态和所述第二成像事件中的信号态来确定。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第三类型的核苷酸缀合物的所述掺入由所述第一成像事件和所述第二成像事件两者中的信号态来确定。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第四类型的核苷酸缀合物的所述掺入由所述第一成像事件和所述第二成像事件两者中的暗态来确定。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述四种类型的核苷酸缀合物包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP或它们的非天然核苷酸类似物。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述混合物中的所述四种类型的核苷酸缀合物中的每一种类型的核苷酸缀合物具有3'羟基封端基团。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法还包括：(e)在所述第二成像事件之后，并且在下一测序循环之前从掺入的核苷酸缀合物中去除所述3'羟基封端基团和所述标记。10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括：针对多个循环重复步骤(a)至步骤(e)；以及基于相继掺入的核苷酸缀合物确定所述靶多核苷酸的所述序列。11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(a)至步骤(e)重复至少50个循环。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第一激发光源和所述第二激发光源中的每一者包括激光、发光二极管(LED)或它们的组合。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一激发光源具有约400nm至
约480nm的波长。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一激发光源具有约450nm至约460n...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小海，吴晓琳，P，
申请(专利权)人：伊鲁米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：