一种利用16SrRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，属于生物技术分子育种技术领域。包括：提取里岔黑猪粪便的总DNA并扩增，建库测序后分析得到与饲料利用率相关的普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息和肠道微生物

【技术实现步骤摘要】
一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法


[0001]本专利技术属于生物技术分子育种
，尤其涉及一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法。

技术介绍

[0002]我国有多种优良的地方猪种质资源，其中里岔黑猪属于山东省著名的地方猪种，兼具瘦肉率高、繁殖力强、适应性强和肉品质好等诸多优良特性。随着养猪产业集约化、规模化的快速发展，里岔黑猪的养殖规模也越来越大。猪的集约化生产中，消耗在饲料上的费用比重超过总支出的60％，猪的饲料利用率在很大程度上影响养殖生产成本和总体经济效益。因此，亟需更加全面且多样化的育种策略，来提高生猪饲料利用率，节约成本，减少粮食资源的浪费，从而减少养殖污染。
[0003]目前的育种方法主要为基因组育种及人工选择育种，但饲料利用率的遗传力较低(0.1～0.2)，仅通过分子育种选择进展缓慢，难以有效对饲料利用率进行改良。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，本专利技术通过检测里岔黑猪肠道菌群，辅助选择具有高饲料利用率的个体，通过与分子育种结合，可以极大提高育种效率，最终降低里岔黑猪养殖成本。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，包括以下步骤：
[0007]1)提取里岔黑猪粪便的总DNA，以所述总DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行建库并测序，得到原始测序序列；
[0008]2)将所述步骤1)得到的原始测序序列使用fastp软件进行质控，并使用FLASH软件进行拼接，过滤得到优化序列；
[0009]3)使用UPARSE软件根据97％的相似性对步骤2)得到的优化序列进行OTU聚类，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列；
[0010]4)采用RDP classifier贝叶斯算法对步骤3)所述的与OTU代表序列相似性在97％以上的序列进行分类学分析，得到与饲料效率相关的普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息；
[0011]5)根据OTU数目和相似性在97％以上的序列信息，计算里岔黑猪肠道微生物的
ɑ
‑
多样性指数；
[0012]6)根据步骤4)得到的相对丰度信息和步骤5)得到的
ɑ
‑
多样性指数辅助里岔黑猪育种；
[0013]所述肠道微生物的
ɑ
‑
多样性指数越低，肠道微生物群落多样性越高，所述里岔黑
猪的饲料利用率越高；
[0014]所述普氏菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越低；
[0015]所述密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高。
[0016]优选的，所述步骤1)PCR扩增使用的引物包括上游引物338F和下游引物806R；
[0017]所述上游引物338F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0018]所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0019]优选的，所述步骤1)PCR扩增的反应体系包括：5
×
FastPfu Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 2μL、浓度为5μM的上下游引物各0.8μL、FastPfu Polymerase0.4μL、BSA 0.2μL、总DNA 10ng，ddH2O补至20μL。
[0020]优选的，所述PCR扩增的程序包括：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，循环30次；72℃10min。
[0021]优选的，所述步骤2)原始测序序列质控和拼接包括：过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10bp；拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列并去除；根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。
[0022]优选的，所述步骤3)OTU聚类包括：对步骤2)获得的优化序列提取非重复序列，并去除没有重复的单序列；按照97％相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列；将所有优化序列map至OTU代表序列，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列。
[0023]优选的，所述步骤4)分类学分析包括：比对Silva 16S rRNA数据库，设置比对阈值为70％。
[0024]优选的，所述步骤5)
ɑ
‑
多样性指数包括Simpson指数。
[0025]本专利技术通过检测其肠道菌群特征，α
‑
多样性指数及相关菌种的丰度：乳酸杆菌属，密螺旋体属，瘤胃球菌属，普氏菌属，辅助判断高饲料利用率和低饲料利用率的个体，结合基因组分子育种技术，能够有效选择高饲料利用率的个体，减少饲料资源的浪费，降低养殖成本，具有极大的辅助育种参考价值。
[0026]本专利技术的有益效果为：
[0027]本专利技术通过检测里岔黑猪粪便样品的肠道菌群数据，分析比对关键菌属丰度及α
‑
多样性指数的高低，能够辅助选择出具有高饲料利用率的里岔黑猪，与现有的分子基因组检测方式结合，能够有效判断里岔黑猪的饲料利用潜力，为精准育种提供了分子基础。其次，本专利技术取粪便进行检测，不会对里岔黑猪造成应激，不影响正常生产，安全性较高，并且16s检测费用低廉，能有效推广利用。
具体实施方式
[0028]实施例1
[0029]本专利技术提供了一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种
的方法，包括以下步骤：
[0030]1)提取里岔黑猪粪便的总DNA，以所述总DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行建库并测序，得到原始测序序列；
[0031]2)将所述步骤1)得到的原始测序序列使用fastp软件进行质控，并使用FLASH软件进行拼接，过滤得到优化序列；
[0032]3)使用UPARSE软件根据97％的相似性对步骤2)得到的优化序列进行OTU聚类，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列；
[0033]4)采用RDP classifier贝叶斯算法对步骤3)所述的与OTU代表序列相似性在97％以上的序列进行分类学分析，得到与饲料效率相关的普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属中的相对丰度信息；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用16S rRNA基因测序技术检测里岔黑猪肠道菌群辅助育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取里岔黑猪粪便的总DNA，以所述总DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物进行建库并测序，得到原始测序序列；2)将所述步骤1)得到的原始测序序列使用fastp软件进行质控，并使用FLASH软件进行拼接，过滤得到优化序列；3)使用UPARSE软件根据97％的相似性对步骤2)得到的优化序列进行OTU聚类，得到与OTU代表序列相似性在97％以上的序列；4)采用RDP classifier贝叶斯算法对步骤3)所述的与OTU代表序列相似性在97％以上的序列进行分类学分析，得到与饲料效率相关的普氏菌属、密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息；5)根据OTU数目和相似性在97％以上的序列信息，计算里岔黑猪肠道微生物的
ɑ
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多样性指数；6)根据步骤4)得到的相对丰度信息和步骤5)得到的
ɑ
‑
多样性指数辅助里岔黑猪育种；所述肠道微生物的
ɑ
‑
多样性指数越低，肠道微生物群落多样性越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高；所述普氏菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越低；所述密螺旋体属、瘤胃球菌属和乳酸杆菌属的相对丰度信息越高，所述里岔黑猪的饲料利用率越高。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增使用的引物包括上游引物338F和下游引物806R；所述上游引物338F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的反应体系包括：5
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵卿尧，刘年丰，
申请(专利权)人：青岛兴牧畜牧科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：