一种简化基因组测序的方法与相关应用技术

本发明专利技术提供了一种简化基因组测序的方法与相关应用。本发明专利技术的简化基因组测序的方法包括：对重测序文库进行限制性内切酶酶切后，分选不含有酶切位点的目标长度的片段进行测序，从而实现简化基因组测序。本发明专利技术在全基因组测序文库的基础上，在测序之前进行限制性内切酶酶切，含有酶切位点的片段因为被切断而不能被测序，从而对基因组上含有酶切位点的片段进行反向选择，实现对基因组的简化。实现对基因组的简化。

【技术实现步骤摘要】
一种简化基因组测序的方法与相关应用


[0001]本专利技术是关于一种对基因组进行简化测序的方法及相关应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]简化基因组测序(Reduced representation genome sequencing，RRGS)是一种将基因组的一部分DNA序列(通常为10％左右)取出来进行测序，用这一部分基因组DNA的多态性代表全基因组水平的多态性的方法。简化基因组测序由于只选择大约10％的基因组进行测序，相比于全基因组测序(Whole genome sequencing，WGS)降低了约90％的测序成本和后续的数据分析成本。
[0003]在农学、医学和生物学等领域，现有的简化基因组测序技术有SLAF
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seq(specific
‑
locus amplified fragment sequencing)、RAD
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seq(Restriction
‑
site
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associated DNA sequencing)、ddRAD
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seq(Double digest restriction
‑
site associated DNA sequencing)和2bRAD
‑
seq等，这些技术的基本原理都是只选择基因组的一部分片段进行测序，达到降低测序成本的目的。其中，SLAF
‑
seq分别利用两种限制性内切酶依次对基因组DNA进行打断，并连接接头后，筛选特定长度片段进行高通量测序，获得测序深度和质量满足要求的SLAF片段来代表样品的全基因组信息。RAD
‑
seq先通过限制性内切酶对基因组进行打断，连接一个接头后再利用超声波进行随机打断，然后连接另外一个接头，并对DNA片段长度进行筛选，筛选出长度合适的片段进行高通量测序。ddRAD使用两种酶同时对基因组进行酶切，再筛选出长度合适的目的片段，然后连接测序接头后对目的DNA片段进行高通量测序。2bRAD是运用II B型限制性内切酶在基因组中切出等长的DNA片段，再对片段进行筛选，然后在片段的两头加上用于测序的接头进行高通量测序。
[0004]然而，上述简化基因组测序技术均存在以下不足之处：1.这些方法都包含DNA的酶切、接头连接、PCR等步骤，操作流程繁琐；2.这些方法的操作流程中包含着一次甚至两次“酶切后连接测序接头”的分子生物学操作步骤，不同DNA片段的酶切和DNA接头连接的效率不同，导致不同DNA片段成功连接DNA接头的数量也不相同。这些差异经过后期的PCR扩增被指数级放大，导致在测序数据中，有的片段被多次测序从而造成数据的浪费，而有些应该被测序的片段却没有被测到从而造成该位点的数据缺失。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的在于提供一种全新的简化基因组测序方法，以解决现有简化基因组测序方法中普遍存在的操作流程繁琐的局限性。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供本专利技术所述的简化基因组测序方法的相关应用。
[0007]本专利技术提供一种新的基因组简化策略，即在全基因组测序文库(Whole genome sequencing,WGS)的基础上，在测序之前对WGS文库进行限制性内切酶酶切，含有酶切位点的片段因为被切断而不能被测序，从而对基因组上含有酶切位点的片段进行反向选择
(Inverse RAD
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seq，iRAD
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seq)，实现对基因组的简化。本专利技术结合高通量WGS文库构建的方法AIO
‑
seq，可以简化传统RAD
‑
seq文库构建的繁琐实验步骤，降低了实验的成本。通过选择不同种类与数量的限制性内切酶，可以控制测序片段数量，增加了片段筛选的灵活性。
[0008]具体而言，本专利技术提供了一种简化基因组测序的方法，该方法包括：对重测序文库进行限制性内切酶酶切后，分选不含有酶切位点的目标长度的片段进行测序，从而实现简化基因组测序。
[0009]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的简化基因组测序的方法中，所述重测序文库可以是现有技术中任何可行方法建立的重测序文库。例如，可以是利用AIO
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seq文库构建方法、True
‑
seq文库构建方法或其它构建重测序文库的方法构建文库。例如，在本专利技术的一些具体实施方案中，可通过转座酶构建重测序文库，能进一步简化传统简化基因组测序的工作流程，其中，构建重测序文库的过程包括：
[0010](1)使用Tn5转座酶复合体对基因组DNA进行随机打断，将Tn5接头在转座酶复合体切割DNA的同时连接到打断位置；
[0011](2)将Tn5转座酶复合体随机打断后的产物作为模板，加入测序使用的接头引物构建PCR反应体系，进行PCR扩增，得到重测序文库；或者，选择性地，经过PCR扩增产物混合、纯化，得到重测序文库。
[0012]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的简化基因组测序的方法中，对重测序文库进行限制性内切酶酶切主要是为简化基因组。具体地，本专利技术中优选切断含有酶切位点的片段以达到60％～95％的简化水平，进一步优选达到75％～95％的简化水平，更进一步优选达到80％～90％的简化水平。
[0013]本专利技术中，所述简化程度是指未被测序的基因组部分占全部基因组的比例，其定义为：简化水平(P
简化水平
)＝(1
‑
大于等于300bp片段的总长度(bp)/基因组的总长度(bp))
×
100％。
[0014]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的简化基因组测序的方法中，可利用任何可行的限制性内切酶对重测序文库基因组DNA进行酶切，以达到预期的简化水平。根据本专利技术的具体实施方案，可以针对具体的物种利用电子酶切评估预定的限制性内切酶的酶切结果，以筛选针对具体物种的限制性内切酶。从而，本专利技术可以通过选择限制性内切酶的种类和数量而控制所获得的目标长度的片段数量和总长度，使得基因组的简化测序变得更加灵活高效。
[0015]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的简化基因组测序的方法中，通常情况下，对重测序文库酶切时，利用1
‑
4种限制性内切酶酶切，优选利用2或3种限制性内切酶酶切。
[0016]在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术的简化基因组测序的方法是用于对水稻、大豆、玉米或小麦等植物物种的基因组进行测序。
[0017]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的简化基因组测序的方法中，所述限制性内切酶包括但不限于MseⅠ、MspⅠ、HindIII、AluⅠ、AluⅠII、Dpn2、HinP1I等中的一种或多种。
[0018]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的简化基因组测序的方法中，对重测序文库进行限制性内切酶酶切后，可分选不含有酶切位点的目标长度的片段进行测序。具体而言，所述的目标长度的片段可以根据后续测序时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种简化基因组测序的方法，该方法包括：对重测序文库进行限制性内切酶酶切后，分选不含有酶切位点的目标长度的片段进行测序，从而实现简化基因组测序。2.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：构建重测序文库；对所构建的重测序文库利用限制性内切酶酶切，切断含有酶切位点的片段以达到60％～95％的简化水平；优选达到75％～95％的简化水平；分选430～580bp的片段，进行测序。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对重测序文库酶切时，利用1
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4种限制性内切酶酶切，优选利用2或3种限制性内切酶酶切。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对重测序文库酶切时，达到80％～90％的简化水平。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，利用AIO
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seq文库构建方法、True
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seq文库构建方法或其它构建重测序文库的方法构建重测序文库。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，构建重测序文库的过程包括：(1)使用Tn5转座酶复合体对基因组DNA进行随机打断，将Tn5接头在转座酶复合体切割DNA的同时连接到打断位置；(2)将Tn5转座酶复合体随机打断后的产物作为模板，加入测序使用的接头引物构建PCR反应体系，进行PCR扩增，得到重测序文库；或者，选择性地，经过PCR扩增产物混合、纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮珏，陈鹏，常玉晓，郭建飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院深圳农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：