一种检测无乳链球菌的分子标记引物及检测方法技术

本发明专利技术公开一种检测无乳链球菌的分子标记引物及检测方法，所述分子标记引物为Sag引物，序列信息见序列表第1至2号序列；所述方法包括以环境样品DNA作为模板，进行PCR扩增的步骤，扩增长度为245bp。与现有的无乳链球菌检测技术相比，本发明专利技术根据发明专利技术人发现的无乳链球菌特有的DNA序列设计特异性引物所建立的PCR检测技术快速、灵敏、准确性高，很好的弥补了细菌培养法和16S rRNA基因序列分析技术的不足。本发明专利技术设计的引物的特异性好，能有效区分近缘种，可作为无乳链球菌具有种的特异性的分子检测靶标。测靶标。测靶标。

【技术实现步骤摘要】
一种检测无乳链球菌的分子标记引物及检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及无乳链球菌检测技术，具体涉及检测无乳链球菌的方法。

技术介绍

[0002]无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是一种革兰氏阳性链球菌，可引起新生儿早发和晚发型感染，也被发现于各种畜牧及水产鱼类的流行病中，可致动物体产生败血症和脑膜炎，且具有较高的致死率。
[0003]随着经济的飞速发展和现代化建设的持续开展，越来越多的室内场所(包括住宅，医院，公共场所，办公室，集体宿舍及教室等)采用集中空调通风系统(以下简称集中空调)调节室内空气微小气候，以改善工作环境，提高生活质量。研究表明，集中空调易成为滋养致病微生物的“温室”，成为致病微生物扩散和传播的载体。这主要是由于集中空调长时间高负荷运行，且未定期清洗或消毒不彻底。因此，检测集中空调通风系统中是否存在致病微生物非常必要。
[0004]无乳链球菌作为集中空调通风系统中已有报道的一种有害微生物，国内外研究者开发了许多种各具特色并可用于不同领域的检测技术。
[0005]传统以微生物培养为基础的检测方法操作复杂，检测时间较长，不能实现快速鉴定的目的。
[0006]伴随着分子生物学技术的快速发展，基于分子生物学的检测技术开始被广泛运用。Berridge等以无乳链球菌的16S
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23S rDNA间区序列为分子标记，建立了快捷、灵敏的PCR检测方法；贾玉萍等基于16S rRNA基因序列开发了无乳链球菌的巢式PCR检测技术；王均、黄锦炉等基于保守的cfb基因和cpsE基因分别研发了双重PCR和三重PCR检测技术。
[0007]然而，现已报道的分子检测靶标均难以有效区分目标微生物与其近缘种。筛选新的具有物种特异性的分子检测靶标在无乳链球菌准确鉴别中非常重要。

技术实现思路

[0008]鉴于此，本专利技术目的之一在于提供一种能够更加准确地检测无乳链球菌的分子标记。
[0009]本专利技术的目的之二在于提供一种能够更加准确地检测无乳链球菌的方法。
[0010]专利技术人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本专利技术提供的技术方案是，提供一种检测无乳链球菌的分子标记引物，所述分子标记引物为Sag引物：
[0011]SagF：5'
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GCAGGTGTTTCATAAGTGGG
‑
3'；
[0012]SagR：5'
‑
GCAGCAGGTGGGATTGGATA
‑
3'。
[0013]本专利技术还提供了一种应用前述分子标记检测无乳链球菌的方法，步骤如下：
[0014]S1、样品采集
[0015]S2、收集微生物
[0016]S3、提取DNA
[0017]提取样品微生物基因组DNA；
[0018]S4、PCR检测
[0019]以待测微生物基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，扩增长度为245bp。
[0020]根据本专利技术方法的一个实施方式，所述步骤S1为：
[0021]以便携式浮游菌采样器或六级撞击式微生物采样器收集空气样品，采样后，滤膜装入无菌采样袋中，在4℃条件下运输至实验室，4h内处理；未能及时处理的样本则保存在
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80℃超低温冰箱中待用。
[0022]根据本专利技术方法的一个实施方式，所述步骤S2为：
[0023]将样品滤膜剪碎，装入15mL无菌离心管，向离心管中加入10mL PBS缓冲液；短暂涡旋；无菌纱布过滤，收集滤液；
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4℃，12000rpm离心15min；弃上清，收集微生物。
[0024]根据本专利技术方法的一个实施方式，所述步骤S3为：
[0025]使用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit试剂盒提取样品微生物基因组DNA。
[0026]根据本专利技术方法的一个实施方式，所述步骤S5中，PCR反应总体系为20μL，其中2
×
Easy PCR SuperMix 10.0μL、上下游引物各lμL、模板DNA1.0μL、ddH2O7μL。
[0027]根据本专利技术方法的一个实施方式，所述步骤S5中，扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
[0028]与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
[0029]a)与现有的无乳链球菌检测技术相比，本专利技术根据专利技术人发现的无乳链球菌特有的DNA序列设计特异性引物所建立的PCR检测技术快速、灵敏、准确性高，很好的弥补了细菌培养法和16S rRNA基因序列分析技术的不足。
[0030]b)引物特异性检测结果表明本专利技术设计的引物的特异性好，能有效区分近缘种，可作为无乳链球菌具有种的特异性的分子检测靶标。
[0031]c)灵敏性试验结果显示本专利技术方法无乳链球菌能检测出的最低DNA模板浓度为1.235
×
103拷贝/μL，方法灵敏性高。
附图说明
[0032]为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0033]图1是无乳链球菌引物特异性检测结果。
[0034]图1中，M：DNA Maker；1：东方拟无枝酸菌；2：大肠杆菌；3：解淀粉芽孢杆菌；4：枯草芽孢杆菌；5：酿脓链球菌；6：马链球菌；7：无乳链球菌。
[0035]图2是PCR退火温度优化结果。
[0036]图2中，M：DNA Marker；1
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9的退火温度分别为60.0℃、59.4℃、58.4℃、56.9℃、55.1℃、53.5℃、52.5℃、52.0℃。
[0037]图3是无乳链球菌检测体系的灵敏度检测结果。
[0038]图3中，1号泳道模板浓度为1.235
×
10
11
拷贝/μL；2
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9为1号样品的10倍梯度稀释液。
[0039]图4是用KOD酶对空调样品进行扩增结果。
[0040]图4中，M：DNA Marker；1..空调样品1；2.空调样品2；3.空调样品3；4.空调样品4；5.空调样品5；6：空调样品6；7：阴性对照。
具体实施方式
[0041]下面结合附图与一个具体实施例进行说明。
[0042]为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施方式中的附图，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测无乳链球菌的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物为Sag引物：SagF：5'
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GCAGGTGTTTCATAAGTGGG
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3'；SagR：5'
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GCAGCAGGTGGGATTGGATA
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3'。2.一种应用权利要求1所述分子标记引物检测无乳链球菌的方法，其特征在于，步骤如下：S1、样品采集S2、收集微生物S3、提取DNA提取样品微生物基因组DNA；S4、PCR检测以待测微生物DNA作为模板，进行PCR扩增，扩增长度为245bp。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤S1为：以便携式浮游菌采样器或六级撞击式微生物采样器收集空气样品，采样后，滤膜装入无菌采样袋中，在4℃条件下运输至实验室，4h内处理；未能及时处理的样本则保存在
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80℃超低温冰箱中待用。4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书五页序列表电子公布附图一页，
申请(专利权)人：成都产品质量检验研究院有限责任公司，
类型：发明
国别省市：