一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，所述培养基含有：10

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，特别是涉及一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）是机体重要的免疫细胞，主要分布在外周血中。NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。
[0003]NK细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增NK细胞，但上述方法扩增的NK细胞与临床需求仍存在一定的差距。如何提供一种可扩增出大量且高活性的NK细胞的培养基，是NK细胞体外扩增领域亟待解决的问题之一。在中国专利申请CN113897334A公开了PD
‑
1阻断剂增强NK细胞杀伤力的用途。NK细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，NK细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放Perforin、GranzymeB到达靶细胞，Perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导GranzymeB进入靶细胞，GranzymeB进入靶细胞后引发靶细胞的DNA断裂使靶细胞凋亡。CD107a也是NK细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。
[0004]此外，在本申请的在先申请CN114606187A中，也公开了一种NK细胞培养基，其特征在于，所述培养基含有：10
‑
20%FBS、50μg/mL 青霉素r/>‑
链霉素溶液的1640培养基；10
‑
200 mg/mL人血浆转铁蛋白；100uM 1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸；1000 IU/mL 人重组IL
‑
2；10
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
15；10
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
18；10
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
21。通过在培养基中加入1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸，能够显著增强NK细胞对K562的杀伤活性,并且该促进作用随着效靶比的增高而增强。
[0005]然而，在申请人的后续研究中发现，仅通过加入1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸，对于增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性的增长有限，为了解决该技术问题，申请人进行了进一步的研究并得以完成本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术主要解决的技术问题是提供一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可扩增出活性高、杀伤性更强的NK细胞。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术的第一个方面，提供一种NK细胞培养基，所述培养基含有：10
‑
20%FBS、40
‑
60μg/mL 青霉素
‑
链霉素溶液的1640培养基；10
‑
200 mg/mL人血浆转铁蛋白；40
‑
90μM 1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸；20
‑
70μM 乙酰谷酰胺；
500
‑
1500 IU/mL 人重组IL
‑
2；10
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
15；10
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
1810
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
21。
[0008]在一种优选的实施方式中，所述培养基中1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸的量为50
‑
80μM；优选为50
‑
60μM。
[0009]在一种优选的实施方式中，所述培养基中乙酰谷酰胺的量为30
‑
70μM；优选为30
‑
40μM。
[0010]本专利技术的第二个方面，提供一种体外扩增NK细胞的方法，所述方法包括：将NK细胞悬于上述NK细胞培养基中，并将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中，并将细胞培养瓶置于培养箱中培养。
[0011]在一种实施方式中，在将NK细胞转移至细胞培养瓶时，将细胞密度调整为1
‑5×
105个/ml。
[0012]在一种实施方式中，所述培养箱参数为湿度饱和、5%CO2、37℃。本专利技术相对于现有技术获得了如下显著的进步：本专利技术首次公开了以特定的比例加入1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸和乙酰谷酰胺的组合刺激条件下，能够显著增强NK细胞的Perforin、Granzyme B、CD107a的表达水平，能够显著增强NK细胞对K562的杀伤活性。
具体实施方式
[0013]以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0014]实施例1 ：NK细胞培养基的制备和体外扩增方法NK细胞培养基配制组分如下：含有 10%FBS、50μg/mL 青霉素
‑
链霉素溶液的 1640 培养基；20mg/mL人血浆转铁蛋白；50μM 1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸；30μM 乙酰谷酰胺；1000 IU/mL 人重组IL
‑
2；50 IU/mL 人重组IL
‑
15；50 IU/mL 人重组IL
‑
21。
[0015]将上述培养基中100uM 1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸组分去除，作为对照组。
[0016]体外扩增NK细胞的方法可按照如下方法进行：1. 人外周血单个核细胞 (PB
‑ꢀ
MC)的分离:静脉血肝素抗凝, Hank' s液等体积稀释, 用 Fi
‑ꢀ
coll进行密度梯度离心, 获取 PBMC, 充分洗涤后调整PBMC密度为 2
ꢀ×
10
9 /L:采用免疫磁珠法纯化NK细胞, 按试剂盒说明书操作 (流式检测表明, NK细胞的纯度 >95%)。
[0017]2. 将制备的NK细胞株悬于上述NK细胞培养基及对照组NK细胞培养基中，调整NK细胞的密度为1
‑5×
105个/ml，转移到T75细胞培养瓶中培养，培养条件为湿度饱和、5%CO2、
37℃的培养箱。
[0018]3. 收集继续培养48h的NK细胞，PBS洗涤并重悬调整细胞密度为1
×
106个/mL，接种于流式管中，每管0.1mL，用PE标记的穿孔素(Perforin)、PE标记的颗粒酶B(Granzyme B)、APC标记的CD107a孵育进行流式细胞术检测，检测结果如表1所示。
[0019]实施例2：与实施例1相同，其区别在于乙酰谷酰胺的量为50μM。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞培养基，其特征在于，所述培养基含有：10
‑
20%FBS、40
‑
60μg/mL 青霉素
‑
链霉素溶液的1640培养基；10
‑
200 mg/mL人血浆转铁蛋白；40
‑
90μM 1,3
‑
二咖啡酰奎宁酸；20
‑
70μM 乙酰谷酰胺；500
‑
1500 IU/mL 人重组IL
‑
2；10
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
15；10
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
18；10
‑
200 IU/mL 人重组IL
‑
21。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中1,3
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：冯春敬，
申请(专利权)人：北京汉氏联合生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：