一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法及其应用。为解决现有技术中因外源性IL

【技术实现步骤摘要】
一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法及其应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体而言，涉及一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法及其应用。

技术介绍

[0002]CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine
‑
Induced Killer，CIK），是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 CD3 和 CD56 两种膜蛋白分子，故又称为NK 细胞（自然杀伤细胞）样T淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性和 NK 细胞的非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK 细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的方案。
[0003]CIK细胞的体外扩增需要外源性细胞因子，如IL
‑
2、IL
‑
7、IL
‑
12等细胞因子的辅助，这些因子控制着人免疫系统内各种抗原特异性细胞的扩增及其生物学活性。外源性IL
‑
2、IL
‑
7、IL
‑
12可以显著促进淋巴细胞的生长，尤其存在有IL
‑
2和IL
‑
7条件下CIK细胞的增殖率为高，且外源性IL
‑
2、IL
‑
7、IL
‑
12对CIK细胞的细胞毒活性没有影响, Marten A等人研究发现，IL
‑
12摄取阻断会减弱CIK细胞的细胞毒活性。外源性IL
‑
2和IL
‑
7的刺激会降低CIK细胞表面相应受体的表达量，而CD28分子在IL
‑
7存在条件下较IL
‑
2时表达更高。IL
‑
12会降低CIK细胞表面ICAM
‑
1的表达，IL
‑
7则会提高CD56的表达。与IL
‑
2相比，IL
‑
7可明显增加CD4+细胞的比例。抗CD3McAb不仅在CIK细胞培养过程中起着重要作用，在提高CIK细胞对白血病及淋巴瘤的杀伤敏感性上同样具有促进作用。Lefterov将抗CD3McAb与靶细胞预先共同孵育可增加CIK细胞对其的杀伤敏感性，而且这种增强作用可以被抗FcR的抗体（如抗CD36、抗CD32）所部分阻断，间接证明抗CD3McAb引发的杀伤活性增高与FcR介导的抗体结合有关。因此，D
‑
CIK细胞应用于恶性肿瘤患者的治疗，有助于解除肿瘤患者体内T细胞的免疫无能，从而提高抗肿瘤活性。
[0004]虽然外源性IL
‑
2、IL
‑
7和IL
‑
12培养过程中均可出现少量凋亡细胞，但有研究显示外源性IL
‑
12的添加会增加CIK细胞中坏死细胞的比例，进而影响后续CIK细胞在肿瘤治疗中的效果。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中存在的技术问题，在使用外源性IL
‑
2、IL
‑
7、IL
‑
12和CD28抗体诱导CIK细胞的体外扩增培养方案的基础上，通过分阶段选择性的添加细胞因子，提供了一种新的人CIK细胞体外扩增的方法及其应用，解决了现有技术中因外源性IL
‑
12的添加导致CIK细胞中坏死细胞比例增加的技术问题。
[0006]具体地，本申请提供了一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法，该方法包括以下步骤：
1）外周静脉血的采集2）单个核细胞（PBMC）的分离3）初次诱导：将分离得到的PBMC接种于添加有IL
‑
2、IL
‑
7和IL
‑
12的初次诱导培养基中培养，其中，IL
‑
2的浓度为900U/mL～1200U/mL，IL
‑
7的浓度为500U/mL～800U/mL，IL
‑
12的浓度为600U/mL～900U/mL；4）再次诱导：使用含有IL
‑
2、IL
‑
7和CD28抗体的再次诱导培养基进行培养，其中，IL
‑
2的浓度为900U/mL～1200U/mL，IL
‑
7的浓度为500U/mL～800U/mL，CD28抗体的浓度为1.5μg/mL～3.0μg/mL。
[0007]5）收获CIK细胞。
[0008]优选地，步骤2）中采用聚蔗糖
‑
泛影葡胺作为分层液进行单个核细胞的分离。
[0009]优选地，步骤3）初次诱导的培养时间为60h。
[0010]优选地，步骤4）再次诱导的培养时间为15d，每隔3d换液，更换的新培养基均为再次诱导培养基。
[0011]优选地，步骤3）中IL
‑
2的浓度为900U/mL～1000U/mL，IL
‑
7的浓度为700U/mL～800U/mL，IL
‑
12的浓度为700U/mL～800U/mL。
[0012]优选地，步骤4）中IL
‑
2的浓度为900U/mL～1000U/mL，IL
‑
7的浓度为700U/mL～800U/mL，CD28的浓度为1.5μg/mL～2.0μg/mL。
[0013]优选地，初次诱导培养基和再次诱导培养基中还添加了体积分数为10%的血清。
[0014]优选地，初次诱导培养基中还添加了IFN
‑
γ，IFN
‑
γ的浓度为300U/mL～400U/mL。
[0015]优选地，还包括对收获的CIK细胞进行计数的步骤。
[0016]本申请还提供了上述人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法在制备CIK细胞中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本申请通过分阶段两次诱导，缩短IL
‑
12诱导作用的时间，避免由于IL
‑
12长时间接触而导致的坏死细胞比例增加。结果显示，本申请的分阶段两次诱导法所得到的CIK细胞中坏死细胞比例明显比现有技术中常用的连续诱导培养法更低，且坏死率受到初次诱导时间的影响，当初次诱导时间为60h时，坏死率最低为1.02%，比对照组降低了69.7%。本申请得到的CIK细胞坏死率低，活性高，能够广泛应用于肿瘤的治疗中。
具体实施方式
[0018]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）外周静脉血的采集；2）单个核细胞（PBMC）的分离；3）初次诱导：将分离得到的PBMC接种于添加有IL
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2、IL
‑
7和IL
‑
12的初次诱导培养基中培养，其中，IL
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2的浓度为900U/mL～1200U/mL，IL
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7的浓度为500U/mL～800U/mL，IL
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12的浓度为600U/mL～900U/mL；4）再次诱导：使用含有IL
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2、IL
‑
7和CD28抗体的再次诱导培养基进行培养，其中，IL
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2的浓度为900U/mL～1200U/mL，IL
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7的浓度为500U/mL～800U/mL，CD28抗体的浓度为1.5μg/mL～3.0μg/mL；5）收获CIK细胞。2.如权利要求1所述的一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法，其特征在于，步骤2）中采用聚蔗糖
‑
泛影葡胺作为分层液进行单个核细胞的分离。3.如权利要求1所述的一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法，其特征在于，步骤3）初次诱导的培养时间为60h。4.如权利要求1所述的一种人CIK细胞体外扩增的分阶段培养方法，其特征在于，步骤4）...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐灿，王东进，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：