一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法技术

本发明专利技术提出了一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法，属于细胞免疫学技术领域，从外周血中获得人单个核细胞后，经过分离纯化后，在含有Daudi细胞培养液的培养液中，低频超声波处理条件下，得到经刺激的γδT细胞，继续加入含有扩增因子的培养液中初步扩增后，进一步加入地西他滨继续培养，得到肿瘤特异性γδT细胞。本发明专利技术方法与常规方法扩增的γδT细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强，对多种恶性肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒性增强。细胞毒性增强。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤特异性
γδ
T细胞及其制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞免疫学
，具体涉及一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法。

技术介绍

[0002]γδT细胞是免疫系统的天然监视细胞，在人体中不断巡逻，识别和靶向肿瘤细胞。γδT细胞还发挥着桥接先天免疫系统和适应性免疫系统的作用，在癌症治疗中，靶向这类细胞蕴含着巨大的潜力。γδT细胞具有先天性和适应性(双重特异性)免疫系统的特性，能够作为这两个关键系统之间的功能桥梁来影响肿瘤杀伤。因此，γδT细胞不仅能够被激活以立即有效地杀死肿瘤细胞，而且它们还具有促进级联反应的潜力，通过细胞因子释放和抗原呈递触发先天性和适应性免疫细胞，产生免疫记忆，诱导有效且持久的抗肿瘤反应。
[0003]δT
‑
细胞免疫治疗的临床发展建立在两种已确定的发现上。第一，在致力于实现Vγ9Vδ2T
‑
细胞的体内扩增时，患有多样恶性肿瘤的患者已用ZA和低剂量IL
‑
2治疗。在许多情况下，这些小研究已将循环Vγ9Vδ2T
‑
细胞数目与延缓的疾病进展相联系。第二，离体扩增的Vγ9Vδ2T
‑
细胞已在若干早期临床试验中作为自体过继性免疫治疗进行测试，这些临床试验涉及多样癌症，包括上皮性卵巢癌(EOC)。尽管这些研究已表明输注的γδT
‑
细胞的安全性，但是临床功效是有限的(甚至当与ZA组合时仍是如此)。这突出了以高效率扩增这些细胞的更好系统的需要，从而产生表现出提高的抗肿瘤活性的细胞。
[0004]由于γδ
‑
T细胞在血液中数量稀少且其增生能力因人而异，因此以γδ
‑
T细胞进行细胞疗法的挑战在于是否能够于体外大量且快速的扩增并活化γδ
‑
T细胞。近几年发现，使用唑来膦酸(Zoledronic acid)能使γδ
‑
T细胞大量增殖，其技术也已经确立。唑来膦酸除了使用在培养γδ
‑
T细胞之外，将唑来膦酸注射到癌症患者体内可以发现癌细胞更大量表现IPP，藉此可以提高γδ
‑
T细胞对癌细胞的灵敏度。然而，唑来膦酸是一种治疗骨质疏松症的药物，用于培养细胞或注射至病患体内仍存在一定疑虑，因此仍极需要开发出一种方便、有效、安全的体外肿瘤特异性γδT细胞的制备方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提出一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法，与常规方法扩增的γδT细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强，对多种恶性肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒性增强，且本专利技术所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、易于规模化生产，具有广阔的应用前景。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]本专利技术提供一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，从外周血中获得人单个核细胞后，经过分离纯化后，在含有Daudi细胞培养液的培养液中，低频超声波处理条件下，得到经刺激的γδT细胞，继续加入含有扩增因子的培养液中初步扩增后，进一步加入地西他滨继续培养，得到肿瘤特异性γδT细胞。
[0008]作为本专利技术的进一步改进，包括以下步骤：
[0009]S1.培养液的配制：将刀豆球蛋白、白介素组合物、干扰素
‑
γ和自体灭活血浆加入RPMI140培养液中，搅拌混合均匀，得到培养液；
[0010]S2.外周血人单个核细胞的制备：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人单个核细胞，用步骤S1制得的培养液洗涤，离心，获得外周血人单个核细胞；
[0011]S3.γδT细胞的分离纯化：将步骤S2得到的外周血人单个核细胞加入步骤S1制得的培养液中，培养1
‑
2d后，加入Anti
‑
human gamma
‑
delta TCR
‑
FITC抗体标记γδT细胞，离心，加入步骤S1制得的培养液，经流式细胞仪分离纯化γδT细胞；
[0012]S4.γδT细胞的刺激：将步骤S3中分离纯化的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，加入Daudi细胞培养液，低频超声波处理，培养2
‑
4d，离心，得到经刺激的γδT细胞；
[0013]S5.γδT细胞的扩增：将步骤S4中经刺激的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调整细胞密度在106‑
107个细胞/mL，加入扩增因子，继续培养，以后每2
‑
3d根据细胞密度补液，保持细胞密度在106‑
107个细胞/mL，直至培养至5
‑
6d时，加入地西他滨，继续培养10
‑
12d，获得肿瘤特异性γδT细胞。
[0014]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述培养液中刀豆球蛋白含量为0.5
‑
20μg/mL，白介素组合物800
‑
2000IU/mL，干扰素
‑
α1b 500
‑
1200units，自体灭活血浆7
‑
12wt％，余量为RPMI140培养液。
[0015]作为本专利技术的进一步改进，所述白介素组合物包括白介素
‑
2、白介素
‑
6、白介素
‑
11，质量比为2
‑
4:1
‑
2:1
‑
3。
[0016]作为本专利技术的进一步改进，所述离心的转速为3000
‑
5000r/min，时间为15
‑
20min。
[0017]作为本专利技术的进一步改进，步骤S4中所述Daudi细胞培养液为用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养的述Daudi细胞，细胞浓度在104‑
105个细胞/mL。
[0018]作为本专利技术的进一步改进，步骤S4中所述低频超声波处理的条件为70
‑
150W超声波。
[0019]作为本专利技术的进一步改进，步骤S5中所述扩增因子为唑来膦酸和干扰素
‑
α1b的混合物，加入培养液后，唑来膦酸浓度为5
‑
15mmol/mL，干扰素
‑
α1b的浓度为700
‑
1500units；所述地西他滨加入培养液后的浓度为2
‑
7mmol/mL。
[0020]作为本专利技术的进一步改进，所述培养条件为36
‑
38℃，CO2浓度为4
‑
7％，氧气浓度为15
‑
30％，余量为氮气，此处％为体积百分比。
[0021]本专利技术进一步保护一种上述的制备方法制得的肿瘤特异性γδT细胞。
[0022]本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过低频超声波处理和肿瘤细胞Daudi细胞刺激下，能增强γδT细胞的生理活性，与常规方法扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，从外周血中获得人单个核细胞后，经过分离纯化后，在含有Daudi细胞培养液的培养液中，低频超声波处理条件下，得到经刺激的γδT细胞，继续加入含有扩增因子的培养液中初步扩增后，进一步加入地西他滨继续培养，得到肿瘤特异性γδT细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.培养液的配制：将刀豆球蛋白、白介素组合物、干扰素
‑
γ和自体灭活血浆加入RPMI140培养液中，搅拌混合均匀，得到培养液；S2.外周血人单个核细胞的制备：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人单个核细胞，用步骤S1制得的培养液洗涤，离心，获得外周血人单个核细胞；S3.γδT细胞的分离纯化：将步骤S2得到的外周血人单个核细胞加入步骤S1制得的培养液中，培养1
‑
2d后，加入Anti
‑
human gamma
‑
delta TCR
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FITC抗体标记γδT细胞，离心，加入步骤S1制得的培养液，经流式细胞仪分离纯化γδT细胞；S4.γδT细胞的刺激：将步骤S3中分离纯化的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，加入Daudi细胞培养液，低频超声波处理，培养2
‑
4d，离心，得到经刺激的γδT细胞；S5.γδT细胞的扩增：将步骤S4中经刺激的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调整细胞密度在106‑
107个细胞/mL，加入扩增因子，继续培养，以后每2
‑
3d根据细胞密度补液，保持细胞密度在106‑
107个细胞/mL，直至培养至5
‑
6d时，加入地西他滨，继续培养10
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12d，获得肿瘤特异性γδT细胞。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述培养液中刀豆球蛋白含量为0.5
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20μg/mL，白介素组合物800
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2000IU/mL，干扰素

【专利技术属性】
技术研发人员：梁信燊，马铎，
申请(专利权)人：广东龄值生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：