一种CIK细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种CIK细胞及其应用，该CIK细胞为颗粒酶B和穿孔素表达增强的CIK细胞。CIK细胞是一种具有较高应用前景的肿瘤治疗细胞，但是其对实体瘤杀伤力有待提高。本发明专利技术发现，王不留行环肽A在体外可以促进CIK细胞表达颗粒酶B和穿孔素，从而对肝癌等实体瘤的杀伤力明显增强。可见，该CIK细胞具有制备抗肝癌等实体瘤药物的价值。实体瘤药物的价值。实体瘤药物的价值。

【技术实现步骤摘要】
一种CIK细胞及其应用


[0001]本专利技术属于细胞治疗领域，涉及CIK细胞，具体涉及一种CIK细胞及其应用。

技术介绍

[0002]细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)是一类异质型细胞群，其主要效应细胞为CD3+CD56+细胞。CIK细胞可通过释放穿孔素和颗粒酶B等途径杀伤肿瘤细胞。CIK细胞治疗的原理是将自体获得的CIK细胞在体外培养后回输到肿瘤患者的体内，使其特异性识别并清除肿瘤患者体内的肿瘤细胞，从而发挥抗肿瘤作用。
[0003]目前，CIK细胞对血液瘤具有较好的治疗效果，但对实体瘤等肿瘤的治疗效果有限。这其中一个原因是CIK细胞对实体瘤细胞的杀伤活性有待增强。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于克服现有技术的不足，提供一种杀伤活力增强的CIK细胞及其应用。
[0005]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0006]一种CIK细胞，该CIK细胞为颗粒酶B和穿孔素表达增强的CIK细胞。
[0007]进一步地，所述颗粒酶B和穿孔素表达增强通过在CIK细胞培养基中添加王不留行环肽A培养实现。
[0008]上述的CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0009]进一步地，所述肿瘤为肝癌。
[0010]有益技术效果：
[0011]CIK细胞是一种具有较高应用前景的肿瘤治疗细胞，但是其对实体瘤杀伤力有待提高。本专利技术发现，王不留行环肽A在体外可以促进CIK细胞表达颗粒酶B和穿孔素，从而对肝癌等实体瘤的杀伤力明显增强。可见，该CIK细胞具有制备抗肝癌等实体瘤药物的价值。
附图说明
[0012]图1为培养12天后检测CD3+CD56+细胞比例的流式图。
[0013]图2为各组CIK细胞对肿瘤Bel
‑
7402细胞的杀伤力。
[0014]图3为western blot结果。
具体实施方式
[0015]一、实验材料
[0016]肝癌Bel
‑
7402细胞购自ATCC。RPMI
‑
1640培养基和FBS购自Gibco。
[0017]人淋巴细胞分离液购自杭州联科生物技术股份有限公司。
[0018]荧光标记的CD3、CD56流式抗体购自Abcam。
[0019]王不留行环肽A购自南京尚书生物科技有限公司，纯度99％。
[0020]细胞培养因子、CCK
‑
8试剂、western blot抗体及试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0021]二、实验方法
[0022]1、外周血单个核细胞分离
[0023]无菌条件下采集适量健康志愿者外周血用于CIK细胞制备。在离心管中加入适量人淋巴细胞分离液，再贴着管壁缓慢加入适量外周血，以避免破坏淋巴细胞分离液的液面。在室温条件下894
×
g离心20min。将淡黄色的单个核细胞层吸出置于离心管中，在室温条件下572
×
g离心6min，弃上清后，沉淀即为外周血单个核细胞。
[0024]2、CIK细胞培养
[0025]将新鲜分离的外周血单个核细胞用含10％FBS的RPMI
‑
1640培养基置于37℃、5％CO2培养条件中培养，第0天加入1000U/mL IFN
‑
γ，24h后补加500U/mL IL
‑
2、50ng/mL OKT3、100U/mL IL
‑
1α、500ng/mLPHA，细胞生长的同时补入新鲜的含500U/mL IL
‑
2和10％FBS的RPMI
‑
1640培养基。培养12天后收集细胞，流式测定CD3+CD56+细胞比例。
[0026]3、分组和干预培养
[0027]将CIK细胞按如下分组干预培养48h：
[0028]对照组：用含10％FBS的RPMI
‑
1640培养基置于37℃、5％CO2培养条件中培养；
[0029]低浓度组：用含7.5μg/mL王不留行环肽A和10％FBS的RPMI
‑
1640培养基置于37℃、5％CO2培养条件中培养；
[0030]高浓度组：用含15μg/mL王不留行环肽A和10％FBS的RPMI
‑
1640培养基置于37℃、5％CO2培养条件中培养。
[0031]4、杀伤力测定
[0032]靶细胞：将Bel
‑
7402细胞用含10％FBS的RPMI
‑
1640培养基置于37℃、5％CO2培养条件中培养，取对数生长期细胞用于试验。
[0033]效应细胞：上述分组干预培养48h的CIK细胞。
[0034]将靶细胞、效应细胞分别用含10％FBS的RPMI
‑
1640培养基制成5
×
104个/mL和2.5
×
105个/mL的细胞悬液，分别取100μL接种于96孔板中(效靶比5:1)，同时设单效应细胞组、单靶细胞组和空白组，每组设5个复孔，置于37℃、5％CO2培养条件中培养48h后，每孔加入10μL CCK
‑
8试剂，继续在培养箱中孵育4h，检测450nm处的OD值，按如下公式计算对肿瘤细胞的杀伤活性：杀伤力(％)＝[1
‑
(效靶组OD值
‑
单效应细胞组OD值)/(单靶细胞组OD值
‑
空白组OD值)]×
100％。
[0035]5、Western blot
[0036]取上述分组干预培养48h的CIK细胞，收集细胞，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。各组取等量总蛋白上样于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，加质量分数5％脱脂奶粉，室温低速摇床封闭1h。加稀释的颗粒酶B、穿孔素、GAPDH一抗，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜4次，每次10min。加稀释的IgG二抗，室温下孵育2h。加ECL发光液显影，胶片曝光，洗片，拍照。
[0037]6、统计学分析
[0038]采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以平均值
±
标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
[0039]三、实验结果
[0040]1、CIK细胞培养
[0041]CIK细胞的主要效应细胞为CD3+CD56+细胞。培养12天后，流式检测显示CD3+CD56+细胞的比例高达81.2％，如图1所示，说明CIK细胞培养成功。
[0042]2、杀伤力测定结果
[0043]各组CIK细胞对肿瘤Bel
‑
7402细胞的杀伤力如表1和图2所示，与对照组比，低浓度组、高浓度组CIK细胞对Bel
‑
7402细胞的杀伤力明显提高(*，P<0.05)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CIK细胞，其特征在于：该CIK细胞为颗粒酶B和穿孔素表达增强的CIK细胞。2.根据权利要求1所述的CIK细胞，其特征在于：所述颗粒酶B和穿孔素表达增强通过在CIK...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：南京良纬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：