一种基于融合蛋白的抗NK细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基技术

本发明专利技术公开了一种基于融合蛋白的抗NK细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基，保护一种抗Natural Killer细胞衰老的融合蛋白—重组人突触融合蛋白12。本发明专利技术细胞试验证明重组人突触融合蛋白12体外干预Natural Killer细胞培养时，可以有效抑制Natural Killer细胞衰老；动物试验证明重组人突触融合蛋白12干预培养的Natural Killer细胞在体内对肿瘤细胞具有更强的杀伤力。这些试验证明重组人突触融合蛋白12不仅可以抗Natural Killer细胞衰老，还可以提高其对肿瘤的杀伤力。还可以提高其对肿瘤的杀伤力。还可以提高其对肿瘤的杀伤力。

【技术实现步骤摘要】
一种基于融合蛋白的抗NK细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基


[0001]本专利技术属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种基于融合蛋白的抗Natural Killer细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基。

技术介绍

[0002]NK细胞是人体先天免疫的核心组成部分，在机体抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。NK细胞具有主要组织相容性复合体(MHC)非限制性杀伤的特点。NK细胞的表型是CD3
‑
CD56+。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤主要包括以下4种途径：(1)穿孔素和颗粒酶介导的直接杀伤；(2)膜肿瘤坏死因子家族分子介导的肿瘤细胞凋亡；(3)通过分泌多种细胞因子，协同抑制或杀伤肿瘤细胞；(4)NK细胞表面表达免疫球蛋白Fc片段的低亲和力受体CD16分子，当它与抗体结合后，会诱导抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)，特异性杀伤与抗体IgG结合的肿瘤细胞。这保证了NK细胞用于肿瘤免疫治疗的效果。
[0003]目前，NK细胞用于肿瘤免疫治疗主要是先获得患者的NK细胞，然后体外培养，再回输到患者体内，以发挥治疗作用。但是，有的患者因为机体自身原因，其NK细胞在体外非常容易衰老，杀伤力较低，导致回输后治疗作用不及预期。
[0004]为了克服部分患者NK细胞体外培养易衰老、回输后杀伤力较低的问题，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于融合蛋白的抗Natural Killer细胞衰老的方法及含有该融合蛋白的培养基。
[0006]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0007]一种抗Natural Killer细胞衰老的融合蛋白，该融合蛋白为重组人突触融合蛋白12。
[0008]一种基于融合蛋白的抗Natural Killer细胞衰老的体外培养方法，在Natural Killer细胞体外培养时给予重组人突触融合蛋白12干预培养。
[0009]一种抗Natural Killer细胞衰老的培养基，该培养基中含有重组人突触融合蛋白12。
[0010]有益技术效果：
[0011]本专利技术细胞试验证明重组人突触融合蛋白12体外干预Natural Killer细胞培养时，可以有效抑制Natural Killer细胞衰老；动物试验证明重组人突触融合蛋白12干预培养的Natural Killer细胞在体内对肿瘤细胞具有更强的杀伤力。这些试验证明重组人突触融合蛋白12不仅可以抗Natural Killer细胞衰老，还可以提高Natural Killer细胞对肿瘤的杀伤力。据此，可以开发相应的Natural Killer细胞培养基。
条件下培养，每2～3天换液，传代，取对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞并确定细胞活力不低于95％，调整细胞终密度为3
×
106/0.2mL细胞悬液备用。
[0031]常规NK细胞：分离纯化的NK细胞用NK细胞培养基在37℃、5％CO2条件下培养12d。
[0032]STX12干预NK细胞：分离纯化的NK细胞用含800ng/mL重组人突触融合蛋白12的NK细胞培养基在37℃、5％CO2条件下培养12d。
[0033]取上述细胞悬液以每只0.2mL接种于裸鼠右下肢外侧皮下，饲养于标准条件的SPF层流实验室中，给予无菌饲料和水自由饮食。接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿，游标尺测量肿瘤大小。待瘤体生长到合适大小时，随机将裸鼠分为2组，每组4只。常规NK细胞组：每隔2d腹腔注射常规NK细胞1
×
106个/0.2mL；STX12干预NK细胞组：每隔2d腹腔注射STX12干预NK细胞1
×
106个/0.2mL。共注射NK细胞5次，最后1次注射次日应用水合氯醛处死裸鼠。剥取肿瘤组织，称重。
[0034]6、统计学分析
[0035]采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以平均值
±
标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验。***P<0.05为差异具有统计学意义。
[0036]三、实验结果
[0037]1、NK细胞分离纯化
[0038]NK细胞免疫磁珠分选是分离纯化NK细胞最高效的手段。经过NK细胞免疫磁珠分选，CD3
‑
CD56+代表的NK细胞的纯度从分选前的9.4％提高到99.3％，NK细胞分离纯化成功。
[0039]2、细胞衰老水平测定
[0040]SA
‑
β
‑
Gal染色阳性的细胞代表衰老细胞。各组染色结果如图1所示，与对照组相比，衰老组阳性细胞明显增多，说明高糖诱导衰老模型成功；与衰老组相比，STX12
‑
A组、STX12
‑
B组阳性细胞明显减少，且可见剂量依赖性，说明STX12干预培养可以有效抗NK细胞衰老。
[0041]3、体内杀伤力测定
[0042]如图2所示，与常规NK细胞相比，STX12干预NK细胞组移植瘤大小和重量均明显降低，说明重组人突触融合蛋白12干预培养的NK细胞在体内对肿瘤具有更强的杀伤力。
[0043]以上实施例是为了具体介绍本专利技术的实质性内容。本领域技术人员应当知道，不应将本专利技术保护范围局限于以上具体实施例。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗Natural Killer细胞衰老的融合蛋白，该融合蛋白为重组人突触融合蛋白12。2.一种基于融合蛋白的抗Natural Killer细胞衰老的体外培养方法，其特征在于：在...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC零七K一四四七，
申请(专利权)人：南京良纬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：