一种基因修饰获得的高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种基因修饰获得的高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞，该CIK细胞为一种lnc000727高表达的CIK细胞。本发明专利技术发现，lnc000727高表达的CIK细胞具有更强的增殖活性和杀伤活性。因此，lnc000727高表达的CIK细胞具有制备抗肿瘤药物的价值，促进CIK细胞中lnc000727高表达的成分具有制备提高CIK细胞增殖活性、杀伤活性的培养基的价值。现有技术没有报道过本发明专利技术技术方案。没有报道过本发明专利技术技术方案。没有报道过本发明专利技术技术方案。

【技术实现步骤摘要】
一种基因修饰获得的高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞


[0001]本专利技术属于细胞治疗领域，涉及CIK细胞，具体涉及一种基因修饰获得的高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞。

技术介绍

[0002]细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)是一类异质型细胞群，其主要效应细胞为CD3+CD56+细胞。CIK细胞可通过释放穿孔素和颗粒酶B等途径杀伤肿瘤细胞。CIK细胞治疗的原理是将自体获得的CIK细胞在体外培养后回输到肿瘤患者的体内，使其特异性识别并清除肿瘤患者体内的肿瘤细胞，从而发挥抗肿瘤作用。
[0003]将自体获得的CIK细胞在体外培养后回输到肿瘤患者的体内，首先是为了获得足够数量的CIK细胞，其次是为了提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。因此，能同时实现这两个目的的培养方法显然较为理想。
[0004]长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA分子，几乎不具备蛋白质编码能力，常以RNA形式直接行使功能。已有研究表明，lncRNA参与调控细胞的分化、发育、衰老及疾病的发生和发展等多种生物学过程。lncRNA可以与DNA、RNA和蛋白质分子等发生相互作用，进而在表观遗传、转录、转录后修饰、翻译及翻译后修饰等多个水平行使功能。Lnc000727是一种被报道与骨质疏松症、人骨髓间充质干细胞成骨分化相关的lncRNA(Osteoporosis Is Characterized by Altered Expression of Exosomal Long Non
‑
coding RNAs.Frontiers in Genetics.2020；Lnc000727促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，基础医学与临床，2022)。
[0005]前期研究发现，高增殖活性的CIK细胞中lnc000727表达异常。目前并没有lnc000727表达变化对CIK细胞增殖和杀伤力影响的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种基因修饰获得的高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞。
[0007]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0008]一种高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞，为一种lnc000727高表达的CIK细胞。
[0009]上述高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0010]进一步地，所述肿瘤为肝癌。
[0011]促进CIK细胞中lnc000727高表达的成分在制备提高CIK细胞增殖活性、杀伤活性的培养基中的应用。
[0012]有益技术效果：
[0013]本专利技术发现，lnc000727高表达的CIK细胞具有更强的增殖活性和杀伤活性。因此，lnc000727高表达的CIK细胞具有制备抗肿瘤药物的价值，促进CIK细胞中lnc000727高表达的成分具有制备提高CIK细胞增殖活性、杀伤活性的培养基的价值。
附图说明
[0014]图1为培养12天后检测CD3+CD56+细胞比例的流式图。
[0015]图2为各组CIK细胞中lnc000727相对表达水平。
[0016]图3为各组CIK细胞增殖率。
[0017]图4为各组CIK细胞杀伤力。
具体实施方式
[0018]一、实验材料
[0019]肝癌Bel
‑
7402细胞购自ATCC。RPMI
‑
1640培养基和FBS购自Gibco。
[0020]人淋巴细胞分离液购自杭州联科生物技术股份有限公司。
[0021]荧光标记的CD3、CD56流式抗体购自Abcam。
[0022]细胞培养因子、CCK
‑
8试剂、Trizol试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0023]Lipofectamine 3000、反转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。
[0024]lnc000727过表达载体质粒、空载以及RT
‑
qPCR引物购自广州锐博生物技术有限公司。
[0025]SYBR Premix Ex Taq
TM
试剂盒购自TaKaRa公司。
[0026]二、实验方法
[0027]1、外周血单个核细胞分离
[0028]无菌条件下采集适量健康志愿者外周血用于CIK细胞制备。在离心管中加入适量人淋巴细胞分离液，再贴着管壁缓慢加入适量外周血，以避免破坏淋巴细胞分离液的液面。在室温条件下894
×
g离心20min。将淡黄色的单个核细胞层吸出置于离心管中，在室温条件下572
×
g离心6min，弃上清后，沉淀即为外周血单个核细胞。
[0029]2、CIK细胞培养
[0030]将新鲜分离的外周血单个核细胞用含10％FBS的RPMI
‑
1640培养基置于37℃、5％CO2培养条件中培养，第0天加入1000U/mL IFN
‑
γ，24h后补加500U/mL IL
‑
2、50ng/mL OKT3、100U/mL IL
‑
1α、500ng/mL PHA，细胞生长的同时补入新鲜的含500U/mL IL
‑
2和10％FBS的RPMI
‑
1640培养基。培养12天后收集细胞，流式测定CD3+CD56+细胞比例。
[0031]3、细胞转染
[0032]收集CIK细胞，用含10％FBS的RPMI
‑
1640培养基重悬，按1
×
105个/孔接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2培养条件中培养，次日按照Lipofectamine3000转染说明书分别将lnc000727过表达载体质粒(过表达组)、空载(空载组)转染至CIK细胞中，同时设置不转染的对照组。转染6h后，更换为含10％FBS的RPMI
‑
1640培养基，转染72h后继续实验。
[0033]4、RT
‑
qPCR检测lnc000727表达
[0034]取转染72h后的CIK细胞，使用Trizol试剂抽提RNA，以反转录试剂盒合成cDNA，使用SYBRPremixExTaq
TM
试剂盒，按照试剂盒使用说明进行扩增。反应结束后分别获取Ct值，以β
‑
actin作为内参，采用2
‑
ΔΔCt
法分析lnc000727的相对表达水平。引物如下：
[0035]lnc000727上游引物：5
′‑
CAGCTCGTTCATGGATGCAA
‑3′
；
[0036]lnc000727下游引物：5
′‑
GAGAGATGTCATTGCCGCAG
‑3′
；
[0037]β
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞，其特征在于：该CIK细胞为一种lnc000727高表达的CIK细胞。2.权利要求1所述的高增殖活性、高杀伤活性的CIK细胞在制备抗肿瘤药物中...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，朱翔，
申请(专利权)人：南京良纬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：