肿瘤特异性CTL细胞的培养方法及细胞治疗产品技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤特异性CTL细胞的培养方法及细胞治疗产品。其中，该培养方法包括：将PBMC体外诱导分化为负载肿瘤新生抗原多肽的成熟DC；将成熟DC与CD8+细胞进行共培养，从而刺激CD8+细胞活化为CTL细胞；对CTL细胞进行扩增。通过在使用负载有CD3/CD28的磁珠刺激CTL细胞进行无差别克隆之前，加入负载有肿瘤特异性抗原肽段的DC对PBMC进行二次刺激，并进一步对每个培养阶段所需时间进行调整和把控，使得这一方法最终的T细胞产物中肿瘤特异性CTL细胞的数量和比例显著提升，同时CTL细胞培养周期缩短。养周期缩短。养周期缩短。

【技术实现步骤摘要】
肿瘤特异性CTL细胞的培养方法及细胞治疗产品


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种肿瘤特异性CTL细胞的培养方法及细胞治疗产品。

技术介绍

[0002]近年来，肿瘤的免疫治疗因其对于常规疗法无效的晚期肿瘤具有显著疗效而受到极大关注。肿瘤免疫治疗(Cancer immunotherapy)是利用自身免疫系统对恶性肿瘤细胞进行特异性杀伤，并尽可能地降低对正常组织的副作用。肿瘤免疫治疗是继化疗和靶向治疗后最具前景的肿瘤治疗方法之一。T细胞是目前认为唯一能够特异性杀伤肿瘤细胞的细胞。DC将抗原提呈给T细胞，诱导T细胞的活化和增殖，包括CD4+辅助性T细胞和CD8+杀伤性T细胞。肿瘤抗原特异性T细胞一直是肿瘤治疗的重要目标。
[0003]作为肿瘤免疫治疗的靶点，肿瘤新生抗原和肿瘤相关抗原已得到了研究者的充分关注。肿瘤相关抗原(TAA,Tumor
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associated antigen)是在肿瘤细胞中表达升高的抗原分子，其在正常细胞中也有一定的表达。也被称为是“自身抗原”，例如癌睾丸抗原家族。因此，肿瘤相关抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤特异性CTL细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：将PBMC体外诱导分化为负载肿瘤新生抗原多肽的成熟DC；将所述成熟DC与CD8+细胞进行共培养，从而刺激所述CD8+细胞活化为CTL细胞；对所述CTL细胞进行扩增。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，将所述PBMC体外诱导分化为负载肿瘤新生抗原多肽的成熟DC包括：分离PMBC并从所述PBMC中分选出CD14+细胞和CD8+细胞；将所述CD14+细胞进行定向分化，得到分化DC；将肿瘤新生抗原多肽与所述分化DC共孵育，得到负载所述肿瘤新生抗原多肽的成熟DC。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，将所述CD14+细胞进行定向分化，得到分化DC包括：采用DC培养基对所述CD14+细胞进行重悬，得到重悬细胞；向所述重悬细胞中加入rh GM
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CSF和rh IL
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4进行定向分化，得到第一阶段分化细胞；向所述第一阶段分化细胞中加入成熟因子继续培养，得到所述分化DC；优选地，所述DC培养基为含人血白蛋白的培养基；更优选地，所述DC培养基是在如下任一种培养基上添加所述人血白蛋白获得：AIM
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V培养基、X
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VIVO 15培养基及CellGenix的树突细胞培养基；进一步优选地，所述人血白蛋白在所述DC培养基中的体积浓度为2.5％，所述rh GM
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CSF的工作浓度为10ng/mL～120ng/mL，rh IL
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4的工作浓度为10ng/mL～120ng/mL；优选地，所述成熟因子选自如下任意一种或多种：rh GM
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CSF、rh IL
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4、rh IL
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1β、rh IL
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6、TNF
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α、PGE
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2及Poly(I:C)；更优选地，各所述成熟因子的终浓度分别如下：rh GM
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CSF的浓度为50ng/mL～200ng/mL，rh IL
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4的浓度为50ng/mL～120ng/mL，rh IL
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1β的浓度为10ng/mL～120ng/mL，rh IL
‑
6的浓度为10ng/mL～120ng/mL，TNF
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α的浓度为10ng/mL～120ng/mL，PEG
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2的浓度为10ng/mL～1000ng/mL，Poly(I:C)的浓度为2μg/mL～40μg/mL；优选地，在第1～2天进行所述定向分化，在第3～5天进行所述继续培养，在第6～9天将所述肿瘤新生抗原多肽与所述分化DC进行共孵育，得到负载所述肿瘤新生抗原多肽的成熟DC；更优选地，所述肿瘤新生抗原多肽的终浓度为0.1～40μg/mL。4.根据权利要求1至3中任一项所述的培养方法，其特征在于，将所述成熟DC与CD8+细胞进行共培养，从而刺激所述CD8+细胞活化为CTL细胞包括：采用所述成熟DC对所述CD8+细胞进行分段刺激，从而使所述CD8+细胞活化为CTL细胞；优选地，采用所述成熟DC对所述CD8+细胞进行预刺激共培养7～10天，得到预活化细胞；采用所述成熟DC对所述预活化细胞进行再刺激共培养1～2天，得到所述CTL细胞。5.根据权利要求1至3中任一项所述的培养方法，其特征在于，对所述CTL细胞进行扩增包括：通过向所述CTL细胞中添加偶联CD3/CD28的单克隆抗体的磁珠或可溶性单克隆抗体的方式扩增所述CTL细胞，得到所述肿瘤特异性CTL细胞；
优选地，将所述CTL细胞与偶联CD3/CD28单克隆抗体的磁珠或可溶性抗
‑
CD3/CD28单克隆抗体进行共培养，优选共培养1～5天，然后转至细胞培养袋或G
‑
REX瓶进行扩大培养，优选扩大培养5～12天，得到所述肿瘤特异性CTL细胞；优选地，所述扩大培养的密度保持在1
×
106～2
×
106个/mL。6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述CTL...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄英，李波，李娜，胡远，安婷，余冰琼，董碘，
申请(专利权)人：武汉华大吉诺因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：