人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用。所述培养基包括基础培养基、诱导因子和添加因子；其中诱导因子包括：地塞米松、TGF

【技术实现步骤摘要】
人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用


[0001]本专利技术涉及干细胞
，特别是一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用。

技术介绍

[0002]关节软骨损伤是临床常见的病症，它不仅在老年人群中高发，近年来也有在年轻群体里高发的趋势。关节软骨内缺乏血管的直接营养、缺少高质量有效迁移能力的软骨细胞和干细胞，这导致关节软骨自我修复能力收到限制。现有多通过手术方法治疗关节软骨损伤，包括软骨下钻孔、微骨折、磨削成形术、关节置换术和自体软骨细胞移植等方法，但这些方法因受技术难度、组织整合差和发育形成纤维软骨的影响存在局限性等缺点，已不能满足临床上对于软骨组织修复治疗的需求，寻求新的治疗手段是目前修复软骨组织损伤亟待解决的问题。
[0003]近年来软骨损伤修复的研究逐渐转向细胞移植软骨组织工程方向，其中软骨细胞和间充质干细胞在软骨组织工程研究领域越来越受到关注。
[0004]人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是间充质干细胞的一种，它具有多向分化潜能，可分化为成软骨细胞。人脐带间充质干细胞容易获取，相对较易受供体年龄因素影响的骨髓间充质干细胞和易受到医学伦理限制的胎儿来源的间充质干细胞而言，此类干细胞具有增殖效率高、供体广泛、病毒感染率低且免疫原性较低等特点，可能成为临床上用于软骨组织工程研究更好的选择。
[0005]人脐带间充质干细胞具有成软骨分化潜能，在体外诱导培养人脐带间充质干细胞向成软骨细胞分化的过程中，通过添加外源性生长因子，可增强人脐带间充质干细胞成软骨分化的能力。其中转化生长因子β(transforming growth factor
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β，TGF
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β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、胰岛素样生长因子
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1(insulin
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like growth factor
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1，IGF
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1)是调节干细胞成软骨分化的几个关键性因子，这些关键因子通过调控几个促进软骨细胞形成的关键基因(COL1、Aggrecan和SOX9)的表达，可诱导干细胞向软骨细胞定向分化。
[0006]通过在培养人脐带间充质干细胞的完全培养基中添加外源性诱导因子可以提高人脐带间充质干细胞成软骨分化的能力。但现有用于诱导人脐带间充质干细胞定向分化为软骨细胞所用诱导培养基，存在定向诱导后软骨细胞数量较少，软骨陷窝分散不均匀且分化效果较差的问题，无法对人脐带间充质干细胞进行有效诱导得到所需软骨细胞，阻碍了细胞移植软骨组织工程领域的各项研究开展。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基、配制方法及其应用。
[0008]本专利技术第一方面提供了一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，所述培养基包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；
[0009]其中基础培养基的组成包括：青霉素、链霉素、谷氨酰胺、FBS和高糖DMEM培养基；
[0010]诱导因子包括：地塞米松、TGF
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β1、维生素C磷酸盐和ITS+1；
[0011]添加因子包括：泽泻醇B；泽泻醇B的加入量(在人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基中的含量)为50μmol/L以上。
[0012]一些具体实施方案中，所用基础培养基、诱导因子可按经典成软骨诱导分化完全培养基中各成分的比例添加配制。
[0013]一些具体实施方案中，泽泻醇B按本专利技术的成软骨诱导分化完全培养基的配制要求选取上限值，例如200μmol/L。
[0014]一些具体实施方案中，本专利技术中所用ITS+1(ITS+1Liquid Media Supplement)是按照10mg/ml重组人胰岛素，0.55mg/ml人转铁蛋白，0.5μg/ml亚硒酸钠，50mg/ml BSA，470μg/ml亚油酸，5ml不含酚红的EBSS的比例加入相应组分配制而成的混合液。
[0015]一些具体实施方案中，本专利技术的培养基主要由上述组分组成(除特别注明外，本专利技术所述培养基或混合液的余量组分为水)。
[0016]为证明本专利技术提供培养基适用于该干细胞的定向分化诱导，配制的培养基根据实验需要设置10个不同分组，并记为A
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F5，每一个组别，用相对应的培养基对人脐带间充质干细胞进行培养，培养到21
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28天时琼脂包埋切片并用阿利新蓝染色液对其进行染色，并在倒置显微镜或正置显微镜下观察不同组合培养基对人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化的分化程度。
[0017]采用本专利技术提供的上述培养基，按现有技术中的常用诱导培养方法，进行软骨细胞分化诱导培养后，所得细胞通过阿利新蓝染色液染色后，在荧光倒置显微镜下观察软骨陷窝，结果发现，与普通培养基及其商业化培养基培养的成软骨细胞相比较，本专利技术提供的培养基组合物F3组培养的软骨细胞内的内酸性粘多糖被阿利新蓝染成蓝色，软骨陷窝间分散平滑，软骨细胞密度及数量远高于其他各类现有培养基及其余泽泻醇B浓度的培养基所得结果。说明本专利技术提供的培养基对人脐带间充质干细胞具有较好定向分化诱导作用，尤其适用于将人脐带间充质干细胞诱导分化培养成软骨细胞。
[0018]一些具体实施方案中，优选地，泽泻醇B的加入量为50μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、150μmol/L或200μmol/L。按这些比例添加泽泻醇B均能取得上述培养分化效果。
[0019]一些具体实施方案中，优选地，泽泻醇B的加入量为100μmol/L。采用该比例添加泽泻醇B，所得软骨细胞数量最多，为经典培养基对照组的6倍。分化效果最优。
[0020]一些具体实施方案中，优选地，青霉素、链霉素、胎牛血清以及谷氨酰胺的用量分别为：
[0021]青霉素：100U/ml，链霉素：100μg/ml，FBS：总体积的5％，谷氨酰胺：2mM/L。
[0022]一些具体实施方案中，优选地，地塞米松、TGF
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β1、维生素C磷酸盐和ITS+1用量分别为：地塞米松：10μg/ml，TGF
‑
β1：10ng/ml，维生素C磷酸盐：50μg/ml，ITS+1：1％。
[0023]诱导因子添加到基础培养基中，配制成经典成软骨诱导分化培养基，该培养基除基础培养基外，还含有10μg/ml地塞米松、10ng/ml TGF
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β1、50μg/ml维生素C磷酸盐和1％ ITS+1；按此比例混合上述物质，能有效协助泽泻醇B发挥对所述干细胞的定向分化作用。
[0024]一些具体实施方案中，优选地，ITS+1各组分用量为：重组人胰岛素：10mg/ml，人转铁蛋白：0.55mg/ml，亚硒酸钠：0.5μg/ml，BSA：50mg/ml，亚油酸：470μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，其原料组成包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；其中基础培养基的组成包括：青霉素、链霉素、谷氨酰胺、FBS和高糖DMEM培养基；诱导因子包括：地塞米松、TGF
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β1、维生素C磷酸盐和ITS+1；添加因子包括：泽泻醇B；泽泻醇B的加入量为50μmol/L以上。2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，其中，所述泽泻醇B的加入量为50
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200μmol/L。3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，其中，所述泽泻醇B的加入量为100μmol/L。4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，其中，所述青霉素、链霉素、胎牛血清以及谷氨酰胺的用量分别为：青霉素：100U/ml，链霉素：100μg/ml，FBS：总体积的5％，谷氨酰胺：2mM/L。5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，其中，所述地塞米松、TGF
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β1、维生素C磷酸盐和ITS+1用量分别为：地塞米松：10μg/ml，TGF
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β1：10ng/ml，维生素C磷酸盐：50μg/ml，ITS+1：总体积的1％。6.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，其中，所述ITS+1各组分用量为：重组人胰岛素：10mg/ml，人转铁蛋白：0.55mg/ml，亚硒酸钠...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐道俊，吴茂友，周巧，李美玲，
申请(专利权)人：赛德特生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：