一种DNA、表达载体、嵌合抗原受体T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种DNA、表达载体、嵌合抗原受体T细胞及其应用，属于肿瘤免疫治疗技术领域。本发明专利技术的DNA，包括编码CCR5的核苷酸序列片段、编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段和编码IL

【技术实现步骤摘要】
一种DNA、表达载体、嵌合抗原受体T细胞及其应用


[0001]本专利技术涉及一种DNA、表达载体、嵌合抗原受体T细胞及其应用，属于肿瘤免疫治疗


技术介绍

[0002]肿瘤的免疫疗法中，CAR T(Chimeric Antigen Receptor T，嵌合抗原受体T)免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面表现出良好的临床疗效，其中，靶向CD19的CAR T细胞已被批准用于治疗CD19阳性淋巴瘤或白血病。但针对实体瘤的CAR T细胞疗法受多种挑战的阻碍，尚未取得预期的疗效。其中，CAR T细胞无法有效归巢至肿瘤部位、肿瘤微环境中CAR T细胞状态及免疫抑制性的肿瘤微环境等是影响CAR T细胞治疗恶性肿瘤特别是实体瘤的关键因素。因此，如何增加实体瘤中CAR T细胞浸润、提高CAR T细胞功能、改善免疫抑制性的肿瘤微环境状况是解决CAR T细胞疗法在实体瘤中应用的重要条件。
[0003]CN111218426A中公开了一种克服肿瘤微环境CAR
‑
T细胞的制备及其用途，并具体提供了一种表达靶向肿瘤细胞表面抗原的嵌合抗原受体CAR和嵌合细胞因子受体(IL
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4R和IL
‑
15R)的工程化免疫细胞。旨在逆转浸润在免疫抑制微环境中的抑制性细胞因子的抑制作用，还可选择性杀伤肿瘤细胞，比如对高表达IL
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4的肝癌细胞(HUH
‑
7)和胰腺癌细胞(Panc
‑
1)杀伤有显著增强。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种DNA，其包括编码CCR5的核苷酸序列片段、编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段和编码IL
‑
12的核苷酸序列片段。
[0005]本专利技术还提供了一种含有上述DNA的表达载体，以及一种含有上述DNA或表达载体的嵌合抗原受体T细胞。
[0006]本专利技术还提供了一种上述DNA、表达载体或嵌合抗原受体T细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。
[0007]为了实现以上目的，本专利技术的DNA所采用的技术方案是：
[0008]一种DNA，其包括编码CCR5的核苷酸序列片段、编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段和编码IL
‑
12的核苷酸序列片段。
[0009]根据本专利技术的具体实施方案，在所述的DNA中，编码CCR5的核苷酸序列片段、编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段和编码IL
‑
12的核苷酸序列片段的排列顺序为：编码CCR5的核苷酸序列片段位于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段的上游，编码IL
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12的核苷酸序列片段位于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段的下游；
[0010]或者，编码IL
‑
12的核苷酸序列片段位于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段的上游，编码CCR5的核苷酸序列片段位于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段的下游；
[0011]或者，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段位于编码CCR5的核苷酸序列片段的上游，编码IL
‑
12的核苷酸序列片段位于编码CCR5的核苷酸序列片段的下游；
[0012]或者，编码IL
‑
12的核苷酸序列片段位于编码CCR5的核苷酸序列片段的上游，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段位于编码CCR5的核苷酸序列片段的下游；
[0013]或者，编码CCR5的核苷酸序列片段位于编码IL
‑
12的核苷酸序列片段的上游，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段位于编码IL
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12的核苷酸序列片段的下游；
[0014]或者，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段位于编码IL
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12的核苷酸序列片段的上游，编码CCR5的核苷酸序列片段位于编码IL
‑
12的核苷酸序列片段的下游。
[0015]本专利技术的DNA，在可表达的嵌合抗原受体的DNA中重组可表达的编码CCR5的核苷酸序列片段和可表达的编码IL
‑
12的核苷酸序列片段，可同时编码CCR5、嵌合抗原受体和IL
‑
12，能够提高嵌合抗原受体T细胞的功能以及浸润肿瘤的能力，同时减弱肿瘤微环境对CAR T细胞的抑制作用，从而增强CAR T细胞的抗肿瘤作用。
[0016]由于趋化因子及其受体在T细胞的迁移中起着至关重要的作用。而趋化因子在肿瘤部位的表达又与T细胞浸润、肿瘤控制和患者预后密切相关。如趋化因子CCL5与实体瘤中的CD8
+
T细胞浸润密切有关，并且CCL5的表达与肿瘤患者生存相关。又如CCL4和CCL5在食管癌患者的肿瘤组织中高表达。本专利技术在表达嵌合抗原受体的DNA中重组表达编码CCR5的核苷酸序列片段后，过表达CCR5(CCL4和CCL5受体)的CAR T细胞可以增加其向肿瘤组织浸润的能力从而清除肿瘤。
[0017]实体瘤肿瘤微环境存在大量免疫抑制细胞和因子，影响CAR T细胞的功能与增殖，限制了CAR T细胞治疗效果。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)是微环境中重要的免疫调节细胞。TAM主要分为2类，即M1和M2细胞。其中，M1细胞发挥肿瘤抑制作用，而M2细胞通过抑制T细胞杀伤、促进血管生成和转移等方式加速肿瘤进展。本专利技术的DNA可以将CAR T细胞转变为IL
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12分泌型细胞，提高肿瘤微环境中IL
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12浓度能够促进M2向M1细胞转化，而减轻肿瘤微环境对CAR T细胞的抑制作用，增强CAR T细胞功能，从而达到更好的肿瘤清除效果；此外，高浓度的IL
‑
12，还可以进一步促进T细胞的增殖和细胞毒性、Th1细胞分化及NK细胞活化等方式增强抗肿瘤反应。
[0018]进一步地，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有信号肽序列、单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和胞内信号域。其中，信号肽可以引导新生的嵌合抗原受体进入细胞内质网。而嵌合抗原受体中的单链抗体可以特异性结合肿瘤细胞膜抗原，具体可根据肿瘤类型进行选择，例如所述嵌合抗原受体中的单链抗体为间皮素单链抗体。本专利技术选择单链抗体为间皮素单链抗体的原因在于间皮素在间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌和其他癌症中高度表达，靶向间皮素的嵌合抗原受体(CAR)具有治疗多种实体恶性肿瘤的潜力。
[0019]为了有效避免免疫排斥，实现高效识别靶细胞，优选地，所述间皮素单链抗体为人源间皮素单链抗体，其编码基因序列选自如下的序列：
[0020]①
SEQ ID NO.5所示序列；
[0021]②
核苷酸序列与SEQ ID NO.5所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％、≥90％、≥95％或≥98％)，且具有靶向或结合于人源间皮素活性的核苷酸序列；
[0022]③
如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的5
’
端和/或3
’
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA，其包括编码CCR5的核苷酸序列片段、编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段和编码IL
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12的核苷酸序列片段。2.根据权利要求1所述的DNA，其中，在所述的DNA中，编码CCR5的核苷酸序列片段、编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段和编码IL
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12的核苷酸序列片段的排列顺序为：编码CCR5的核苷酸序列片段位于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段的上游，编码IL
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12的核苷酸序列片段位于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段的下游；或者，编码IL
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12的核苷酸序列片段位于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段的上游，编码CCR5的核苷酸序列片段位于编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段的下游；或者，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段位于编码CCR5的核苷酸序列片段的上游，编码IL
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12的核苷酸序列片段位于编码CCR5的核苷酸序列片段的下游；或者，编码IL
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12的核苷酸序列片段位于编码CCR5的核苷酸序列片段的上游，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段位于编码CCR5的核苷酸序列片段的下游；或者，编码CCR5的核苷酸序列片段位于编码IL
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12的核苷酸序列片段的上游，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段位于编码IL
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12的核苷酸序列片段的下游；或者，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列片段位于编码IL
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12的核苷酸序列片段的上游，编码CCR5的核苷酸序列片段位于编码IL
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12的核苷酸序列片段的下游。3.根据权利要求1所述的DNA，其中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有信号肽、单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和胞内信号域；优选地，单链抗体为间皮素单链抗体；进一步优选地，所述间皮素单链抗体为人源间皮素单链抗体，其编码基因序列选自：SEQ ID NO.5所示序列；核苷酸序列与SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，古松海，刘婷怡，闫忠辉，张建，
申请(专利权)人：赛德特生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：