【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及慢病毒载体及其应用。
技术介绍
1、目前临床上针对肿瘤患者有多种治疗手段，比如放化疗、抗体、adc、免疫检查点抑制剂、免疫细胞治疗等，每种治疗手段各有优势，与其他传统药物不同的是，细胞治疗是一种高度个性化的精准治疗，其药物形式是一种活的免疫细胞。目前在临床上取得突破进展的是car-t，其在血液瘤方面具有显著的治疗的效果，但因为自体car-t属于高度个性化的精准治疗，其生产和质控成本昂贵、治疗周期较长，且制备成功率不高，因此急需开发通用型的细胞治疗技术。
2、car-nk属于仅次于car-t的研究较热门的通用型细胞治疗技术，其依赖于nk的受体识别不受mhc限制，无gvhd风险，另外nk细胞是天然的肿瘤杀伤细胞，可以天然识别并杀伤广谱的肿瘤细胞，加上car结构后使得nk对肿瘤细胞的识别更加精准，从而提高其肿瘤的杀伤功能。
3、不管是car-t还是car-nk，其制备过程中均涉及到对免疫细胞的基因修饰，也就是car基因的导入。常见的car基因的导入方式包括慢病毒转导、γ-逆转录病毒转导、脂质体瞬转、电穿孔等，目前主流的针对免疫细胞的car基因修饰主要以慢病毒和γ-逆转录病毒转导为主，由于γ-逆转录病毒载体偏向于插入到宿主启动子附近，因此具有更高的插入突变风险，在临床研究中需要更多的考虑到其遗传毒性。相比γ逆转录病毒，慢病毒载体在临床应用中具有更高的安全性。
4、目前已上市的car-t产品大多数采用的是慢病毒载体进行car基因修饰。传统的慢病毒载体是经vsv g（水疱性口炎
5、除了car-nk外，γδt、hsc等都属于比较难转染的细胞，常规的vsvg包膜的慢病毒难以实现稳定的转导。因此迫切需要开发一种新型的慢病毒载体，使其能够稳定高效的转导大多数难以转染的细胞。
6、在wo2013/045639a1中（法国里昂），首次公开了使用修饰的狒狒内源性逆转录病毒(baev)包膜糖蛋白假型化的病毒载体转导静止hsc以及静息t和b细胞的方法。该技术涉及的嵌合包膜糖蛋白，包含或由baev包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒（mlv）包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成，即baevtr；或修饰的baev包膜糖蛋白，其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽,即baevrless。如图1所示：
7、该技术的专利技术主要针对造血系统的遗传障碍（如免疫缺陷），通过对hsc、静息t或b进行基因修饰，达到基因治疗或免疫治疗的目的。该专利采用gfp为核心表达蛋白，采用baev和mlv嵌合组成的包膜糖蛋白融合体假型化的慢病毒载体，与vsv g假型化的慢病毒载体做对比研究，发现对于hsc、静息t和b具有显著的转导效率，但在nk细胞的转导效率，该专利未做相应的研究。
8、在wo2019121945a1（美天旎），采用跟上述法国里昂同样的结构设计，将其应用到nk细胞的转导，提供了nk细胞的一种培养转导方案，采用gfp以及cd19 car为表达蛋白，研究了与wo2013/045639a1中相同的假型化的慢病毒载体即baevtr或baevrless，两者在外周血来源的nk细胞上的转导效率。相比vsv g，具有显著的转导效率。
9、现有技术采用baev的跨膜和胞外结构域与mlv的胞质尾进行组合，形成一种嵌合形式的包膜糖蛋白，或者野生型的baev去掉r肽。现有技术重点提供了gfp的转导效率，因gfp本身是一个相对比较容易表达的蛋白，而在其他蛋白如car这种跨膜蛋白的研究数据较少。综合已报道数据以及本实验室实验验证，现有的技术缺点主要有，（1）相比vsv g包膜，baevtr或baevrless的病毒滴度急剧下降；（2）baevtr或baevrless对包装细胞的毒性明显，尤其是baevrless，引起293t细胞产生合胞体的现象非常明显。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了慢病毒载体及其应用。
2、本专利技术提供了慢病毒载体及其应用。本专利技术对病毒包膜的胞质尾区进行一系列的优化设计，该区域与病毒颗粒的成熟和出芽效率相关，提高了假型化慢病毒的滴度，并提高了nk细胞的转导效率。
3、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
4、本专利技术提供了pr2在制备假型化病毒的包膜胞质尾区蛋白和/或假型化病毒的包膜蛋白中的应用：
5、所述pr2具有：
6、①、如seq id no.7所示的氨基酸序列；或
7、②、在如①所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
8、③、与如①所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的氨基酸序列。
9、在本专利技术的一些具体实施方案中，编码所述pr2的核酸分子具有：
10、④、如seq id no.8所示的氨基酸序列；或
11、⑤、在如④所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
12、⑥、与如④所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的氨基酸序列。
13、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种；
14、所述假型化病毒包括baev、hiv、mlv、vsv、rd114或galv中的一种或多种。
15、本专利技术还提供了包膜胞质尾区蛋白，具有：
16、（ⅰ）、如seq id no.1所示的氨基酸序列；或
17、（ⅱ）、在如（ⅰ）所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
18、（ⅲ）、与如（ⅰ）所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的氨基酸序列。
19、在上述研究的基础上，本专利技术还提供了编码所述包膜胞质尾区蛋白的核酸分子。
20、在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有：
21、（ⅳ）、如seq id no.2所示的核苷酸序列；或
22、（ⅴ）、与（ⅳ）所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（ⅳ）所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
23、（ⅵ）、与（ⅳ）或（ⅴ）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（ⅳ）或（ⅴ）所示的核苷酸序列功能相同或相似本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.病毒包膜蛋白，其特征在于，包括包膜胞质尾区蛋白、Surface Unit、Ectodomain和TM：
2.基因元件，其特征在于，包括编码包膜胞质尾区蛋白的核酸分子、Surface Unit、Ectodomain和TM的核酸分子：
3.慢病毒载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的基因元件。
4.如下任意项在包装病毒、提高病毒滴度、降低对包装细胞的毒性和/或提高细胞转导效率中的应用：
5.病毒颗粒，其特征在于，包括如权利要求3所述的慢病毒载体。
6.宿主，其特征在于，包括如下任意项：
7.如下任意项在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用：
8.药物或药物组合，其特征在于，所述药物以如下任一项为原材料，以及药学上可接受的辅料或助剂；
【技术特征摘要】
1.病毒包膜蛋白，其特征在于，包括包膜胞质尾区蛋白、surface unit、ectodomain和tm：
2.基因元件，其特征在于，包括编码包膜胞质尾区蛋白的核酸分子、surface unit、ectodomain和tm的核酸分子：
3.慢病毒载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的基因元件。
4.如下任意项在包装病毒、提高...
【专利技术属性】
技术研发人员：闫忠辉，何丽花，古松海，蔡晓晴，徐道俊，刘婷怡，
申请(专利权)人：赛德特生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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