System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 慢病毒载体及其应用制造技术_技高网

慢病毒载体及其应用制造技术

技术编号:41311533 阅读:4 留言:0更新日期:2024-05-13 14:54
本发明专利技术涉及生物技术领域,具体涉及慢病毒载体及其应用。本发明专利技术对嵌合包膜的胞质尾区的蛋白酶底物序列进行了优化设计,得到一系列新型嵌合包膜结构,所得包膜结构用来假型化携带CAR基因的慢病毒载体,相比已报道的嵌合型包膜BaEVTR或BaEVRless,本发明专利技术的包膜结构假型化的慢病毒载体具有更高的病毒滴度,并且对包装细胞的毒性没有明显增加,甚至毒性是微弱的。本发明专利技术的慢病毒载体对NK、静息T、静息B或单核细胞、γδT、HSC具有更高的转导效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物,具体涉及慢病毒载体及其应用


技术介绍

1、目前临床上针对肿瘤患者有多种治疗手段,比如放化疗、抗体、adc、免疫检查点抑制剂、免疫细胞治疗等,每种治疗手段各有优势,与其他传统药物不同的是,细胞治疗是一种高度个性化的精准治疗,其药物形式是一种活的免疫细胞。目前在临床上取得突破进展的是car-t,其在血液瘤方面具有显著的治疗的效果,但因为自体car-t属于高度个性化的精准治疗,其生产和质控成本昂贵、治疗周期较长,且制备成功率不高,因此急需开发通用型的细胞治疗技术。

2、car-nk属于仅次于car-t的研究较热门的通用型细胞治疗技术,其依赖于nk的受体识别不受mhc限制,无gvhd风险,另外nk细胞是天然的肿瘤杀伤细胞,可以天然识别并杀伤广谱的肿瘤细胞,加上car结构后使得nk对肿瘤细胞的识别更加精准,从而提高其肿瘤的杀伤功能。

3、不管是car-t还是car-nk,其制备过程中均涉及到对免疫细胞的基因修饰,也就是car基因的导入。常见的car基因的导入方式包括慢病毒转导、γ-逆转录病毒转导、脂质体瞬转、电穿孔等,目前主流的针对免疫细胞的car基因修饰主要以慢病毒和γ-逆转录病毒转导为主,由于γ-逆转录病毒载体偏向于插入到宿主启动子附近,因此具有更高的插入突变风险,在临床研究中需要更多的考虑到其遗传毒性。相比γ逆转录病毒,慢病毒载体在临床应用中具有更高的安全性。

4、目前已上市的car-t产品大多数采用的是慢病毒载体进行car基因修饰。传统的慢病毒载体是经vsv g(水疱性口炎病毒)包膜假型化的hiv-1,其对t细胞具有较高的转导效率,但主要转导处于分裂期的细胞,对于静息状态的细胞几乎没有感染效率。另外对于难转染的细胞如hsc、nk细胞、b细胞几乎没有转导效率。即使在培养基中添加不同细胞因子组合刺激后并使用较高比例的慢病毒转导,在nk细胞上也只能观察到约10%的转导效率,这可能跟nk细胞的天然抗病毒防御机制有关。

5、除了car-nk外,γδt、hsc等都属于比较难转染的细胞,常规的vsvg包膜的慢病毒难以实现稳定的转导。因此迫切需要开发一种新型的慢病毒载体,使其能够稳定高效的转导大多数难以转染的细胞。

6、在wo2013/045639a1中(法国里昂),首次公开了使用修饰的狒狒内源性逆转录病毒(baev)包膜糖蛋白假型化的病毒载体转导静止hsc以及静息t和b细胞的方法。该技术涉及的嵌合包膜糖蛋白,包含或由baev包膜糖蛋白的跨膜和胞外结构域与鼠白血病病毒(mlv)包膜糖蛋白的胞质尾结构域的融合体组成,即baevtr;或修饰的baev包膜糖蛋白,其中胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽,即baevrless。如图1所示:

7、该技术的专利技术主要针对造血系统的遗传障碍(如免疫缺陷),通过对hsc、静息t或b进行基因修饰,达到基因治疗或免疫治疗的目的。该专利采用gfp为核心表达蛋白,采用baev和mlv嵌合组成的包膜糖蛋白融合体假型化的慢病毒载体,与vsv g假型化的慢病毒载体做对比研究,发现对于hsc、静息t和b具有显著的转导效率,但在nk细胞的转导效率,该专利未做相应的研究。

8、在wo2019121945a1(美天旎),采用跟上述法国里昂同样的结构设计,将其应用到nk细胞的转导,提供了nk细胞的一种培养转导方案,采用gfp以及cd19 car为表达蛋白,研究了与wo2013/045639a1中相同的假型化的慢病毒载体即baevtr或baevrless,两者在外周血来源的nk细胞上的转导效率。相比vsv g,具有显著的转导效率。

9、现有技术采用baev的跨膜和胞外结构域与mlv的胞质尾进行组合,形成一种嵌合形式的包膜糖蛋白,或者野生型的baev去掉r肽。现有技术重点提供了gfp的转导效率,因gfp本身是一个相对比较容易表达的蛋白,而在其他蛋白如car这种跨膜蛋白的研究数据较少。综合已报道数据以及本实验室实验验证,现有的技术缺点主要有,(1)相比vsv g包膜,baevtr或baevrless的病毒滴度急剧下降;(2)baevtr或baevrless对包装细胞的毒性明显,尤其是baevrless,引起293t细胞产生合胞体的现象非常明显。


技术实现思路

1、有鉴于此,本专利技术提供了慢病毒载体及其应用。

2、本专利技术提供了慢病毒载体及其应用。本专利技术对病毒包膜的胞质尾区进行一系列的优化设计,该区域与病毒颗粒的成熟和出芽效率相关,提高了假型化慢病毒的滴度,并提高了nk细胞的转导效率。

3、为了实现上述专利技术目的,本专利技术提供以下技术方案:

4、本专利技术提供了pr在制备假型化病毒的包膜胞质尾区蛋白和/或假型化病毒的包膜蛋白中的应用:

5、所述pr包括pr1和/或pr12:

6、①、所述pr1具有如seq id no.7所示的氨基酸序列;或

7、②、所述pr12具有如seq id no.29所示的氨基酸序列;或

8、③、在如①或②所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列;或

9、④、与如①或②所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的氨基酸序列。

10、在本专利技术的一些具体实施方案中,

11、⑤、编码所述pr1的核酸分子具有如seq id no.8所示的氨基酸序列;或

12、⑥、编码所述pr12的核酸分子具有seq id no.30所示的氨基酸序列;或

13、⑦、在如⑤或⑥所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列;或

14、⑧、与如⑤或⑥所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的氨基酸序列。

15、在本专利技术的一些具体实施方案中,所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种;

16、所述假型化病毒包括baev、hiv、mlv、vsv、rd114或galv中的一种或多种。

17、本专利技术还提供了包膜胞质尾区蛋白,具有:

18、(ⅰ)、如seq id no.1或seq id no.3所示的氨基酸序列;或

19、(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列;或

20、(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同源性的氨基酸序列。

21、在上述研究的基础上,本专利技术还提供了编码所述包膜胞质尾区蛋白的核酸分子。

22、在本专利技术的一些具体实施方案中,所述核酸分子具有:

23、(ⅳ)、如seq id no.2或seq id no.4所示的核苷酸序列;或

24、(本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.PR在制备假型化病毒的包膜胞质尾区蛋白和/或假型化病毒的包膜蛋白中的应用:

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种;

3.包膜胞质尾区蛋白,其特征在于,具有:

4.编码如权利要求3所述的包膜胞质尾区蛋白的核酸分子。

5.如权利要求4所述的核酸分子,其特征在于,具有:

6.如下任意项在制备假型化病毒的包膜蛋白中的应用:

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种;

8.病毒包膜蛋白,其特征在于,包括如权利要求3所述的包膜胞质尾区蛋白、SurfaceUnit、Ectodomain和TM:

9.如权利要求8所述的病毒包膜蛋白,其特征在于,具有:

10.基因元件,其特征在于,包括如权利要求4或5所述的核酸分子、Surface Unit、Ectodomain和TM的核酸分子:

11.如权利要求10所述的基因元件,其特征在于,具有:

12.慢病毒载体,其特征在于,包括如权利要求10或11所述的基因元件。

13.如下任意项在包装病毒、提高病毒滴度、降低对包装细胞的毒性和/或提高细胞转导效率中的应用:

14.病毒颗粒,其特征在于,包括如权利要求12所述的慢病毒载体。

15.宿主,其特征在于,包括如下任意项:

16.如下任意项在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用:

17.如权利要求16所述的产品,其特征在于,所述产品包括药物和/或疫苗。

18.药物,其特征在于,以如下任一项为原材料,以及药学上可接受的辅料或助剂;

19.药物组合,其特征在于,包括如权利要求18所述的药物以及其他任意有效成分。

20.治疗方法,其特征在于,向受试者施用如下任意项:

21.疫苗,其特征在于,包括如下任意项:

22.预防方法,其特征在于,向受试者施用如权利要求21所述的疫苗。

...

【技术特征摘要】

1.pr在制备假型化病毒的包膜胞质尾区蛋白和/或假型化病毒的包膜蛋白中的应用:

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种;

3.包膜胞质尾区蛋白,其特征在于,具有:

4.编码如权利要求3所述的包膜胞质尾区蛋白的核酸分子。

5.如权利要求4所述的核酸分子,其特征在于,具有:

6.如下任意项在制备假型化病毒的包膜蛋白中的应用:

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述假型化病毒包括慢病毒或γ-逆转录病毒的一种或多种;

8.病毒包膜蛋白,其特征在于,包括如权利要求3所述的包膜胞质尾区蛋白、surfaceunit、ectodomain和tm:

9.如权利要求8所述的病毒包膜蛋白,其特征在于,具有:

10.基因元件,其特征在于,包括如权利要求4或5所述的核酸分子、surface unit、ectodomain和tm的核酸分子:

11....

【专利技术属性】
技术研发人员:闫忠辉何丽花古松海蔡晓晴徐道俊刘婷怡
申请(专利权)人:赛德特生物制药有限公司
类型:发明
国别省市:

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