一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时鉴定鸡细小病毒、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和禽腺病毒血清4型(FADV4)这三种病毒的LAMP引物和探针组合、试剂盒及检测方法，包括三种病毒对应的3套引物组、3种不同颜色的探针，检测反应过程仅包括等温扩增和终止，最终在同一个反应管中完成三重荧光LAMP反应，反应后根据三种探针的不同颜色鉴别诊断出三种病毒，最低能检测到1copy/μL病毒DNA，整个检测过程简便、快速、无需使用昂贵仪器、成本低，特异性和敏感性高、干扰性小，能够实现现场病原检测，适用于鸡群的大规模诊断筛查。断筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法


[0001]本专利技术涉及兽用生物制品
，特别涉及一种同时可以鉴定鸡细小病毒，鸡传染性贫血病毒和禽腺病毒血清4型这三种病毒的可视化的方法，尤其是一种三重荧光的LAMP联合鉴定的方法。

技术介绍

[0002]鸡细小病毒(Chicken parvovirus，CHPV)，鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anaemia virus,CIAV)和禽腺病毒血清4型(Fowl Aviadenovirus Serotype 4,FADV4)是近年来造成鸡群新发传染病的常见的三种病毒，这三种病毒的共性是DNA病毒，主要感染35日龄以下雏鸡，经常混合感染，还会出现各种并发症，是引起家禽养殖的传染病传播的主要病原体。CHPV主要引起禽肠炎综合症和发育障碍与矮小综合症，以腹泻、精神沉郁、体温调节障碍、生长迟缓、饲料消耗增加为临床特征，研究表明该病在我国鸡群中普遍存在，感染率高达38.9％～88.1％，商品肉鸡的感染率较高，种鸡和蛋鸡次之。CIAV可引起鸡全身淋巴组织萎缩，特别是骨髓造血组织和淋巴组织萎缩，导致免疫抑制，临床症状为生长迟缓、贫血、骨髓再生障碍、胸腺萎缩等。不同年龄的鸡均可感染CIAV，但临床症状主要出现在10～14日龄。CIAV在全球范围内流行，我国鸡CIAV抗体阳性率高达70％，该病既可垂直传播也可水平传播，临床上呈典型或隐性感染，继发感染其它病原体导致鸡群死亡。FADV4主要引起心包积水－包涵体肝炎综合病，发病迅速、死亡率高，近年来我国禽腺病毒血清4型感染连续暴发，对我国家禽养殖造成了巨大影响。
[0003]目前三种实验室病毒鉴定的方法主要依靠传统的病毒分离、琼脂扩散试验、ELISA，以及现在常用的DNA序列测定技术、PCR检测等，这些方法或是耗时、费力、敏感性低，或是依赖专门的仪器、成本较高、或是只能做单一病毒鉴定，最多2种病毒联检等弊端。近年来,这种三种病毒的混合感染在我国的发病率呈上升趋势,对养鸡业造成了很大的经济损失。因此，急需建立快速、准确、联合的诊断方法，保障养禽业的健康发展。
[0004]环介导等温扩增(loop
‑
mediated isothermal amplification,以下简称LAMP)技术是反应混合物在等温(58
‑
67℃)条件下进行扩增，具有快速、简便和敏感的特性，但也由于其自身技术上的局限，全球多重LAMP方法一直未有较大的进展，无论是单重还是多重，阳性结果的荧光颜色和沉淀物颜色都一样，不能确定具体到底是由哪一种阳性反应所引起的结果，因此进行多重区分比较困难。此外，多重荧光受限于现有的荧光成像分析系统固定范围内的波长、荧光淬灭复合探针对反应的抑制、增加的引物和探针争夺反应体系，因此，还没有关于LAMP技术同时鉴定三种病原体的三重荧光LAMP检测产品或方法的相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种同时鉴定鸡细小病毒(CHPV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和禽腺病毒血清4型(FADV4)这三种病毒的三重荧光LAMP检测方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术要求保护一种引物和探针组合物，包括3套引物和探针，
分别为：根据鸡细小病毒的NS基因序列设计的外引物CHPV
‑
F3和CHPV
‑
B3、内引物CHPV
‑
FIP和CHPV
‑
BIP、环引物CHPV
‑
Floop和CHPV
‑
Bloop及探针CHPV
‑
FD和CHPV
‑
BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1
‑
8所示；根据鸡传染性贫血病毒的VP1基因序列设计的外引物CIAV
‑
F3和CIAV
‑
B3、内引物CIAV
‑
FIP和CIAV
‑
BIP、环引物CIAV
‑
Floop和CIAV
‑
Bloop及探针CIAV
‑
FD和CIAV
‑
BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:9
‑
16所示；根据禽腺病毒血清4型的Hexon基因序列设计的外引物FADV4
‑
F3和FADV4
‑
B3、内引物FADV4
‑
FIP和FADV4
‑
BIP、环引物FADV4
‑
Floop和FADV4
‑
Bloop及探针FADV4
‑
FD和FADV4
‑
BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:17
‑
24所示。
[0007]本专利技术要求保护的引物和探针组合物，其中的3套引物和探针，与对应SEQ ID NO:1
‑
24所示的序列相比,分别具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加，或者分别具有80％
‑
99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No:1
‑
24的序列具有相同功能。
[0008]本专利技术要求保护的引物和探针组合物，其中的内引物CHPV
‑
FIP和CHPV
‑
BIP、CIAV
‑
FIP和CIAV
‑
BIP及FADV4
‑
FIP和FADV4
‑
BIP序列的5
’
端标记有淬灭基团，探针CHPV
‑
FD和CHPV
‑
BD、CIAV
‑
FD和CIAV
‑
BD及FADV4
‑
FD和FADV4
‑
BD序列的3
’
端标记荧光基团。
[0009]本专利技术要求保护的引物和探针组合物，其中的淬灭基团为BHQ系列荧光淬灭基团，荧光基团为Alexa Fluor 488、Cy5和CY3。
[0010]本专利技术要求保护的引物和探针组合物，其中的内引物CHPV
‑
FIP、CHPV
‑
BIP、CIAV
‑
FIP、CIAV
‑
BIP、FADV4
‑
FIP、FADV4
‑
BIP和对应探针CHPV
‑
FD、CHPV
‑
BD、CIAV
‑
FD、CIAV
‑
BD、FADV4
‑
FD、FADV4
‑
BD的核苷酸序列拥有互补配对的区域，退火后配对结合形成不发光的荧光淬灭复合探针CHPV
‑
FIP
‑
FD、CHPV
‑
BIP
‑
BD、CIAV
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物和探针组合物，其特征在于：包括3套引物和探针，分别为：根据鸡细小病毒的NS基因序列设计的外引物CHPV
‑
F3和CHPV
‑
B3、内引物CHPV
‑
FIP和CHPV
‑
BIP、环引物CHPV
‑
Floop和CHPV
‑
Bloop及探针CHPV
‑
FD和CHPV
‑
BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1
‑
8所示；根据鸡传染性贫血病毒的VP1基因序列设计的外引物CIAV
‑
F3和CIAV
‑
B3、内引物CIAV
‑
FIP和CIAV
‑
BIP、环引物CIAV
‑
Floop和CIAV
‑
Bloop及探针CIAV
‑
FD和CIAV
‑
BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:9
‑
16所示；根据禽腺病毒血清4型的Hexon基因序列设计的外引物FADV4
‑
F3和FADV4
‑
B3、内引物FADV4
‑
FIP和FADV4
‑
BIP、环引物FADV4
‑
Floop和FADV4
‑
Bloop及探针FADV4
‑
FD和FADV4
‑
BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:17
‑
24所示。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于：所述3套引物和探针，与对应SEQ ID NO:1
‑
24所示的序列相比,分别具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加，或者分别具有80％
‑
99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No:1
‑
24的序列具有相同功能。3.根据权利要求1
‑
2任一项所述的引物和探针组合物，其特征在于：所述内引物CHPV
‑
FIP和CHPV
‑
BIP、CIAV
‑
FIP和CIAV
‑
BIP及FADV4
‑
FIP和FADV4
‑
BIP序列的5
’
端标记有淬灭基团，所述探针CHPV
‑
FD和CHPV
‑
BD、CIAV
‑
FD和CIAV
‑
BD及FADV4
‑
FD和FADV4
‑
BD序列的3
’
端标记荧光基团。4.根据权利要求3所述的引物和探针组合物，其特征在于：所述淬灭基团为BHQ系列荧光淬灭基团，所述荧光基团为Alexa Fluor 488、Cy5和CY3。5.根据权利要求3所述的引物和探针组合物，其特征在于：所述内引物CHPV
‑
FIP、CHPV
‑
BIP、CIAV
‑
FIP、CIAV
‑
BIP、FADV4
‑
FIP、FADV4
‑
BIP和对应探针CHPV
‑
FD、CHPV
‑
BD、CIAV
‑
FD、CIAV
‑
BD、FADV4
‑
FD、FADV4
‑
BD的核苷酸序列拥有互补配对的区域，退火后配对结合形成不发光的荧光淬灭复合探针CHPV
‑
FIP
‑
FD、CHPV
‑
BIP
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，范晴，李小凤，谢志勤，谢丽基，黄娇玲，张艳芳，曾婷婷，王盛，罗思思，李孟，李丹，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：