一种临床检测猴痘的方法技术

本发明专利技术涉及临床检测猴痘技术领域，且公开了一种临床检测猴痘的方法，包括提取猴痘假病毒基因组DNA，其具体操作步骤包括：S1：样本预处理；S101：取200μL回温至室温的血清等体液，转移至1.5mL的DNase/RNase

【技术实现步骤摘要】
一种临床检测猴痘的方法


[0001]本专利技术涉及临床检测猴痘
，具体为一种临床检测猴痘的方法。

技术介绍

[0002]猴痘(Monkeypox)是一种病毒性人畜共患病，由猴痘病毒(Monkeypoxvirus)引起，典型临床表现为发热、皮疹和淋巴结肿大，并可能导致一系列并发症。病毒最早在猴子身上发现。猴痘病毒分为两个支系：西非支系和刚果盆地(中非)支系。主要发生在中非和西非的热带雨林地区，有时也输出到其他地区，动物宿主包括一系列啮齿动物和非人灵长类动物。猴痘病毒通过与病变、体液、呼吸道飞沫和被褥等污染物质密切接触而在人与人之间传播。猴痘的潜伏期通常为6至13天，但也可为5至21天。猴痘通常是自限性的，但在某些人，如儿童、孕妇或由于其他健康状况而免疫抑制的人身上可能很严重。与刚果盆地支相比，西非支的人类感染引起的疾病似乎不那么严重，病死率为3.6％，而刚果盆地支的病死率为10.6％。
[0003]猴痘病毒在分类上属痘病毒科(Poxviridae)、痘病毒脊索亚科(Chrodopoxvirnae)、正痘病毒属(Orthopoxvirus)，同属还有天花病毒和牛痘病毒。猴痘病毒与天花病毒有共同抗原，二者之间有很强的血清交叉反应，故猴痘流行期间，可接种牛痘进行预防。外形为圆角砖形或卵圆形，大小为200～400nm；外被脂蛋白膜或封套，中间具有两个含蛋白质的侧体，有1个厚膜核心，核心内为双链DNA基因体；基因组为双链DNA，长约197kb，基因组末端包含序列相同但方向相反的末端反向重复序列；基因组包含190个开放阅读框，GC含量较低(约33％)；能抵抗乙醚，对干燥有较强抵抗力，易被氯仿、甲醇或福尔马林灭活；分为两个支系：西非支系和刚果盆地(中非)支系。
[0004]MPXV基因组由一个线形双链DNA(197kb)组成，末端由回文发夹结构共价连接，反向末端重复序列(ITR)由发夹环、串联重复序列和一些开放阅读框组成。虽然MPXV是一种DNA病毒，但它的整个生命周期都发生在受感染细胞的细胞质中。病毒DNA复制、转录、病毒粒子组装和出口所需的所有蛋白质都由MPXV基因组编码。编码管家功能的基因在痘病毒(OPV)中高度保守，存在于基因组的中心区域，而编码病毒
‑
宿主相互作用的基因则不太保守，位于末端区域。
[0005]MPXV感染宿主细胞后，显著抑制NK细胞在内的淋巴细胞表达，这也是宿主淋巴结肿大的关键原因，研究表明，MPXV通过人与人之间的接触传播较差，MPXV利用细胞相关病毒血症通过其感染宿主传播。MPXV对MHCI类分子的细胞内转运的调控也与MPXV逃避抗病毒CD8+T细胞应答的机制有关。MPXV使用的免疫逃避机制模式抑制了与MPXV感染细胞同源互作后CD4+和CD8+T细胞的活化，从而保护病毒DNA免受宿主免疫监测。抗病毒CD4+和CD8+T细胞对MPXV感染的单核细胞识别能力较差，表明MPXV不通过病毒特异性T细胞触发炎症细胞因子(IFNγ或TNFα)的产生，但病毒能有效地感染单核细胞。
[0006]猴痘的最佳诊断样本来自皮肤病变——囊泡和脓疱的顶部或液体，以及干燥的结痂。在可行的情况下，活检是一种选择。病变样本必须储存在干燥、无菌的试管中(无病毒运
输介质)并保持低温。由于病毒血症的持续时间较短，不建议使用血液进行检测。确诊需要使用realtime PCR和测序。由于正痘病毒属间存在血清交叉反应，因此不推荐对人群使用血清抗体检测

技术实现思路

[0007](一)解决的技术问题
[0008]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种临床检测猴痘的方法，设计猴痘B6R基因特异性引物后，引入一条特异性引物探针，该探针在其5＇加入FAM序列，3＇加入MGB序列。
[0009](二)技术方案
[0010]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种临床检测猴痘的方法，包括提取猴痘假病毒基因组DNA，其具体操作步骤包括：
[0011]S1：样本预处理；
[0012]S101：取200μL回温至室温的血清等体液，转移至1.5mL的DNase/RNase
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free离心管中；
[0013]S102：加入400μL裂解液LB并加入4μL Carrier RNA储存溶液，立即涡旋震荡混匀15sec；
[0014]S103：然后将S102震荡后的液体进行静置；
[0015]S104：加入450μL无水乙醇，立刻涡旋振荡15sec充分混匀；
[0016]S2：DNA/RNA提取；
[0017]S201：将RNA吸附柱V1套入2mL收集管中，备用；
[0018]S202：将预处理混合液加入到RNA吸附柱V1中，然后再进行对其进行离心震荡，弃掉废液；
[0019]S203：再次加入500μL去蛋白液，然后再进行对其进行离心震荡，弃掉废液；
[0020]S204：再将RNA吸附柱V1放回收集管，加入500μL漂洗液，然后再进行对其进行离心震荡，弃掉废液；
[0021]S205：再将RNA吸附柱V1放回收集管，空柱进行离心震荡，以除去残留的漂洗液；
[0022]S206：将RNA吸附柱V1放入新的洁净DNase/RNase
‑
free 1.5mL离心管中，在RNA吸附柱V1中央加入30
‑
50μL RNase
‑
free H2O，室温放置1min；然后进行离心震荡后收集滤液即为检测所需的样本DNA或RNA；
[0023]S3：将S206中得到的样品进行保存；
[0024]S4：将提取出的猴痘假病毒基因组，并进行梯度稀释；
[0025]S5：然后进行qPCR检测并建立标准曲线。
[0026]优选的，所述S103中，静置条件为室温(15
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25℃)放置10min。
[0027]优选的，S104中，当周围环境高30℃，无水乙醇需要冰上预冷后再加入。
[0028]优选的，S202中，离心频率为12000rpm，离心时间为1min。
[0029]优选的，S203中，离心频率为12000rpm，离心时间为30min。
[0030]优选的，S204中，离心频率为12000rpm，室温环境下离心时间为30min。
[0031]优选的，S205中，离心频率为12000rpm，在室温环境下离心2min。
[0032]优选的，S206中，离心频率为12000rpm，离心1min。
[0033]优选的，S3中的样品置于
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20℃短期保存，
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80℃长期保存。
[0034](三)有益效果
[0035]与现有技术相比，本专利技术提供了一种临床检测猴痘的方法，具备以下有益效果：
[0036]1、该一种临床检测猴痘的方法，提高TM值—平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种临床检测猴痘的方法，其特征在于，包括提取猴痘假病毒基因组DNA，其具体操作步骤包括：S1：样本预处理；S101：取200μL回温至室温的血清等体液，转移至1.5mL的DNase/RNase
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free离心管中；S102：加入400μL裂解液LB并加入4μL Carrier RNA储存溶液，立即涡旋震荡混匀15sec；S103：然后将S102震荡后的液体进行静置；S104：加入450μL无水乙醇，立刻涡旋振荡15sec充分混匀；S2：DNA/RNA提取；S201：将RNA吸附柱V1套入2mL收集管中，备用；S202：将预处理混合液加入到RNA吸附柱V1中，然后再进行对其进行离心震荡，弃掉废液；S203：再次加入500μL去蛋白液，然后再进行对其进行离心震荡，弃掉废液；S204：再将RNA吸附柱V1放回收集管，加入500μL漂洗液，然后再进行对其进行离心震荡，弃掉废液；S205：再将RNA吸附柱V1放回收集管，空柱进行离心震荡，以除去残留的漂洗液；S206：将RNA吸附柱V1放入新的洁净DNase/RNase
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free 1.5mL离心管中，在RNA吸附柱V1中央加入30
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50μL RNase
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free H2O，室温放置1min；然后进行离心震荡后收集滤液即为检测所需的样本DNA或RNA；S3...

【专利技术属性】
技术研发人员：席德先，阚虎飞，
申请(专利权)人：江苏艾菱菲生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：