一种多病原体的联合检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种病毒检测试剂盒，可以同时检测日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒，试剂盒中包括SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种多病原体的联合检测试剂盒


[0001]本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及脑炎致病微生物的核酸诊断，更具体涉及日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒联合检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)简称乙脑病毒，是一种造成人类乙型脑炎(俗称大脑炎)的病原体。在分类学上，乙脑病毒属于披膜病毒科(Togaviridae)，黄病毒属第1亚群(Flavivirus belongs to subgroup 1)，为单股RNA病毒，它会造成高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征等，通过蚊虫媒介快速传播，且病死率高。
[0003]森林脑炎病毒是一种能够引起森林地区的自然疫源性疾病即森林脑炎的病原体，为单股正链RNA病毒，属黄病毒科黄病毒属，因为蜱虫是其主要传播媒介，又称蜱传脑炎病毒(tick
‑
borne encephalitis virus，TEV)。森林脑炎病毒感染主要表现为高热、头痛、意识障碍、脑膜刺激征等，严重者可在数小时内因昏迷、抽搐、延髓麻痹而死亡。
[0004]西尼罗病毒(West nile virus，WNV)属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，能够导致急性传染的人畜共患病西尼罗病毒病。感染西尼罗病毒后会伴有头痛、发热、皮疹、淋巴结肿大等症状，少数人可表现为西尼罗病毒性脑炎、脑膜脑炎和脑膜炎。
[0005]登革病毒(Dengue virus，DENV)属于黄病毒科黄病毒属的一个血清型亚群，为单股正链RNA病毒，以抗原性为依据可将其分为1、2、3、4共四个血清型，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊进行传播，能够引起人类登革热以及发病率和致死率都较高的登革出血热和登革休克综合征。
[0006]病毒性脑炎是指一大类能够导致中枢神经系统感染性疾病，累及脑膜和脑实质的炎症，导致病毒性脑炎的病原体种类多种多样，其中主要的病原体有肠道病毒、疱疹病毒、虫媒病毒、副黏病毒、弹状病毒以及腺病毒等，临床上常见的有肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、脊髓灰质炎病毒、日本乙型脑炎病毒、登革病毒、西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒、森林脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒等。该类病原体引起的疾病临床表现大致相似，患者均表现为发热、头痛、意识障碍、抽搐以及肢体活动障碍等症状，单从临床表现和体征很难区分感染病原体，不同病原体引起的感染，其治疗方案不同。
[0007]病毒性脑炎病原体可以通过粪便、飞沫、蚊虫、鸟类进行传播，引起严重病毒性脑炎的病原体具有感染力强、传播范围广、发病率和病死率较高等特点，可引起广泛的脑炎和脑膜炎疾病，早诊断、早治疗、早隔离是防治的根本。但由于病毒型脑炎致病原种类繁多，给疾病诊断和预防带来巨大的挑战，建立一种准确快速的鉴别诊断方法意义重大。在实验室诊断手段中，一般采取对单个病原体或少数几个病原体进行核酸检测或者病毒分离和鉴定，这样时间较长，不利于对疫情快速采取应对措施。因此亟需一种不但准确性高、病原体覆盖广的快速检测方法。
[0008]申请号为CN201710204099.0的中国专利中公开了一种用于病毒性脑炎快速诊断
的多重PCR试剂盒，能够快速检测六种病毒性脑炎：单纯疱疹病毒1型(HSVⅠ)、单纯疱疹病毒2型(HSVⅡ)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、肠道病毒71型(EV71)及巨细胞病毒(CMV)；其中的6对引物能够特异性扩增HSVⅠ、HSVⅡ、EBV、CMV、EV71、VZV，引物之间互不干扰，构建的mPCR体系敏感性为102‑
103拷贝，针对临床疑似病毒性脑炎患者15例脑脊液标本，检出6份阳性标本，其中HSVⅠ5例，CMV1例。但其针对的病毒种类有限，因此实际应用时，很多其他病毒引起的病症无法进行检测。

技术实现思路

[0009]为了解决上述问题，本专利技术提供了用于同时检测日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒的引物和探针及检测方法，涉及一种用于生物样本中上述四种病原体的多重核酸PCR检测的引物、探针及方法。采用上述引物和探针可通过多重PCR技术对日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒同时进行检测。
[0010]一方面，本专利技术提供了一种脑炎病原体检测引物组合物。
[0011]所述脑炎病原体检测引物组合物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示序列的引物。
[0012]所述的引物使用浓度可以为0.05μM
‑
5μM。
[0013]优选地，所述的引物组合物中各引物的检测靶点和使用浓度如下：
[0014][0015]本专利技术引物组合物在PCR反应中使用时至少进行一个循环步骤，这个循环步骤可以包括扩增步骤和/或染料结合步骤。扩增步骤通常包括将样本与某一对上述4种病原体引物接触，以便在样品中存在病原体核酸分子时产生病原体扩增产物。扩增产物的检测和分辨可以采用多种方法(如对扩增产物的测序、琼脂糖凝胶电泳分析、SYBR荧光染料法、TaqMan探针法等)。
[0016]另一方面，本专利技术提供了一种脑炎病原体检测组合物。
[0017]所述的脑炎病原体检测组合物中包括前述的引物组合物和探针序列。
[0018]优选地，所述的探针序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13中的一种或多种。
[0019]所述的引物使用浓度可以为0.05μM
‑
5μM。
[0020]优选地，所述的探针序列的检测靶点和使用浓度如下：
[0021]检测靶点探针序列使用浓度日本乙型脑炎病毒探针SEQ ID NO:30.25pmol/μL森林脑炎病毒探针SEQ ID NO:60.0625pmol/μL西尼罗病毒探针SEQ ID NO:90.0625pmol/μL登革病毒探针SEQ ID NO:130.0625pmol/μL
[0022]再一方面，本专利技术提供了前述的引物组合物和/或脑炎病原体检测组合物在制备日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒联合检测试剂盒中的应用。
[0023]优选地，所述的试剂盒为PCR检测试剂盒。
[0024]所述的试剂盒中包括前述的引物组合物和/或脑炎病原体检测组合物。
[0025]优选地，所述的试剂盒中包括前述的脑炎病原体检测组合物。
[0026]所述的脑炎病原体检测组合物通过单管PCR反应完成扩增。
[0027]所述的脑炎病原体检测组合物在试剂盒中可以分开提供，也可以混合提供。
[0028]所述的试剂盒中还包括酶混合液，所述的酶混合液中包括Neoscript RT逆转录酶和H
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脑炎病原体检测引物组合物，其特征在于，所述脑炎病原体检测引物组合物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示序列的引物。2.一种脑炎病原体检测组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的脑炎病原体检测引物组合物，还包括序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13的探针中的一种或多种。3.权利要求1所述的脑炎病原体检测引物组合物或权利要求2所述的脑炎病原体检测组合物在制备日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒联合检测试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脑炎病原体检测组合物通过单管PCR反应完成扩增。5.一种病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的脑炎病原体检测引物组合物或...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏静明，娄萍萍，马洪昌，任小梅，刘佳，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：