一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒技术

本申请公开了一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒；属于生物检测技术领域；所述检测SARS

【技术实现步骤摘要】
一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒
[0001]

[0002]本申请涉及一种生物检测
，更具体地说，尤其涉及一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒。

技术介绍

[0003]新型冠状病毒肺炎( Coronavirus Disease 2019, COVID
‑
19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（the novel severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS
‑
CoV
‑
2）引起，新冠的全球传播对各个国家构成了多方面威胁。
[0004]SARS
‑
CoV
‑
2是一种具有30 kb基因组的正链单链RNA病毒，其形态为圆形或椭圆形，直径约60
‑
140nm，在电镜下可观察到包膜上存在的刺突糖蛋白。
[0005]SARS
‑
CoV
‑
2基因组的前端为编码16种非结构蛋白的ORF1ab区域，其余部分编码几种辅助蛋白和四种结构蛋白，包括刺突 (spike,S) 糖蛋白、包膜 (envelope,E)、基质 (matrix,M) 和核衣壳蛋白 (nucleocapsid,N) ，它们对于维持新冠病毒的结构完整性有着重要意义。
[0006]根据SARS
‑
CoV
‑
2的全基因组序列，国家卫健委推荐新冠病毒的三个特异性区域（ORF1ab基因、N基因和E基因）适合作为PCR扩增区域。
[0007]MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）是一种混合多种酶的核酸恒温扩增技术，基础型的MIRA法试剂盒主要包括以下几种酶：
①
能够与寡核苷酸（即引物、探针）形成复合物并带领引物探针找到匹配模板的重组酶；
②
单链结合蛋白（SSB）；
③
能够进行单链置换的DNA聚合酶；
④
用以识别四氢呋喃修饰位点具有核酸内切酶活性的Endonuclease IV（nfo酶）。同时，由于新冠病毒为RNA病毒，其在扩增过程中又加入了反转录酶步骤。
[0008]申请人经过文献调研，发现以下文献：文献1：CN112831600A提供了一种检测SARS
‑
CoV
‑
2病毒的引物探针组合，所述检测SARS
‑
CoV
‑
2病毒的引物探针组合特异性扩增并检测SARS
‑
CoV
‑ꢀ
2病毒的ORF1ab基因、N基因或E基因中的任意一种或至少两种的组合。
[0009]文献2：CN111733293A提供了一种检测SARS
‑
COV
‑
2的双链引物探针，所述双链引物探针包括用于检测SARS
‑
COV
‑
2病毒的ORF1ab、N和E基因序列的特异性引物探针。本专利技术采用双链引物探针来减少引物自身形成茎环结构或引物之间形成二聚体的机率，使得PCR扩增效率达到一致，从而解决了多重PCR之间的竞争性抑制，实现了SARS
‑
COV
‑
2病毒ORF1ab、N和E多个靶基因的单管同时检测。
[0010]文献3：KR20220004468A用PNA探针同时诊断SARS
‑
CoV
‑
2和引起冠状病毒感染19的salvecovirus的方法和试剂盒。
[0011]文献4：CN113817868A提供了一种用于检测新型冠状病毒及其变异株的引物、探针
组合物及试剂盒。
[0012]文献5：CN111534641A提供了一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用。
[0013]申请人在先申请“2022110650049”提出了一种核酸检测装置，其设计思路是在反应仓中预先设置有扩增体系，样本在反应仓中进行扩增；然后得到的扩增产物流动到层析试纸上来显示结果，其要求是在：尽可能短的时间内完成扩增，显示结果。
[0014]申请人基于检索式：“层析试纸 andE基因”，发现了现有技术CN112981008A，该技术采用了RPA扩增技术，其可在37
‑
42℃的条件下需要20分钟实现靶标基因的扩增；然而，对于家庭环境，20分钟的测量时间仍然偏长。同时，灵敏度也是核酸检测的核心指标，灵敏度越高，意味着初阳人员也能检验出来。
[0015]因此，结合实际使用，本申请的研发目标是研发适合的引物、探针、层析试纸，以便完成下述目标：1）恒温扩增时间指标：控制在10分钟；2）灵敏度指标：扩增体系内的样本在100copies/ml，也能有较高的检出率。

技术实现思路

[0016]本申请的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒。
[0017]本申请的技术方案是：一种用于检测2019
‑
nCoVE基因的引物，其核苷酸序列为：上游引物序列：CGTTTCGGAAGAGAYAGGTACGTTAATAGT(SEQ ID No.1)；下游引物序列：[5
’‑
Biotin]‑
AGATCAGGAACTCTAGAAGAATTCAGATTTTTA(SEQ ID No.2)。
[0018]一种用于检测2019
‑
nCoVE基因的探针，其核苷酸序列为：探针序列：[5
’
FAM]‑
TCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGT[THF]AACGTGAGTCTTGT
‑
[3
’
C3spacer] (SEQ ID No.3)。
[0019]一种用于检测2019
‑
nCoVE基因的引物探针组合，所述检测SARS
‑
nCoV病毒的引物探针组合特异性扩增并检测SARS
‑
nCoV病毒的E基因；扩增所述E基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述E基 因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0020]进一步，所述引物有一个修饰位点：下游引物5
’
端标记生物素（Biotin）；所述探针有四个修饰位点：探针5
’
端标记FAM；探针距离5
’
端约30nt、距离3
’
端约15nt位置设置一个四氢呋喃（THF)修饰位点；探针3
’
端进行C3
‑
spacer修饰。
[0021]一种试剂盒，所述试剂盒包括前述的组合物。
[0022]一种试剂盒，其用于检测2019
‑
nCoV，所述试剂盒包括：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物，用于检测2019
‑
nCoV的E基因，其特征在于，核苷酸序列为：上游引物序列：CGTTTCGGAAGAGAYAGGTACGTTAATAGT；下游引物序列：[5
’‑
Biotin]
‑
AGATCAGGAACTCTAGAAGAATTCAGATTTTTA。2.一种探针，用于检测2019
‑
nCoV的E基因，其特征在于，核苷酸序列为：探针序列：[5
’
FAM]
‑
TCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGT[THF]AACGTGAGTCTTGT
‑
[3
’
C3spacer]。3.一种组合物，是用于检测SARS
‑
nCoV病毒的引物探针组合物，所述引物探针组合物特异性扩增并检测SARS
‑
nCoV病毒的E基因；其特征在于：扩增所述E基因的特异性引物的核苷酸序列为：上游引物序列：CGTTTCGGAAGAGAYAGGTACGTTAATAGT；下游引物序列：[5
’‑
Biotin]
‑
AGATCAGGAACTCTAGAAGAATTCAGATTTTTA；所述探针的核苷酸序列为：探针序列：[5
’
FAM]
‑
TCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGT[THF]AACGTGAGTCTTGT
‑
[3
’
C3spacer]。4.一种层析试纸，其特征在于，包括PVC底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫；样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫沿着溶液流动方向依次布置在所述底板上，样品垫与结合垫部分重合，结合垫与检测垫部分重合，吸水垫与检测垫部分重合；结合垫与检测垫重合1mm，吸水垫与检测垫重合1mm；其中，所述结合垫中包含：FAM抗体
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显色颗粒复合物、DNP
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显色颗粒复合物，所述FAM抗体
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显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成；所述DNP
‑
显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成；其中，所述检测垫包括硝酸纤维素膜，在检测垫上设置检测区域、、质控区域；检测区域经由链霉亲和素加载在硝酸纤维素膜上形成；质控区域其经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成。5.根据权利要求4所述的一种层析试纸，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈新利，魏爱琪，李美琼，傅明华，张亭，聂晶，
申请(专利权)人：江苏迅睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：