双联核酸检测层析试纸、引物及探针组、试剂盒制造技术

本申请公开了一种双联核酸检测层析试纸、引物及探针组、试剂盒；属于生物检测技术领域；所述检测SARS

【技术实现步骤摘要】
双联核酸检测层析试纸、引物及探针组、试剂盒


[0001]本申请涉及一种生物检测
，更具体地说，尤其涉及一种双联核酸检测层析试纸、引物及探针组、试剂盒。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒2019
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nCoV的全球大规模爆发，核酸检测是目前用于早期诊断新型冠状病毒的主要方法。
[0003]新型冠状病毒是一种单链正义RNA病毒，其基因组组成与其他冠状病毒相似，基因组中包含6个ORF，包括复制酶ORF 1a、ORF 1b等，还有4种结构蛋白基因：刺突蛋白(spike protein,S)，包膜蛋白(envelope protein,E)，膜蛋自(membrane protein,M)，核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)。
[0004]新型冠状病毒的基因突变频率很高，加大了检测的难度。通过对2019
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nCoV野生型和目前世卫组织公布的重点突变株的ORF1基因(简称O基因)进行对比分析，在保守序列区域设计了一组能够与申请人研发的层析试纸适配的恒温核酸扩增引物、探针成为一个研发的难点。
[0005]同时，根据《新型冠状病毒(2019
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nCoV)核酸检测试剂注册审查指导原则》等文件要求，为提高检测的准确性，核酸检测试剂盒中必须包含内参检测用以内部监测。tRNA的合成过程较为复杂，首先是在细胞核内合成含有额外序列的pre
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RNA，而RNase P行使的核酸内切酶活性，对tRNA的最终活性形成有着至关重要的作用。RNase P是人体中主要的核酸酶之一，广泛分布于各个器官细胞中，也因此能够成为人源样本的检测内源性内参。本申请针对指导原则的这一点要求，选择了RNA酶P(RNase P)基因作为内参靶标研究对象，以期设计了一组恒温扩增引物，与其他恒温扩增试剂盒匹配使用，用以检测咽拭子、鼻拭子从采样到扩增全过程的合格性。
[0006]同时，申请人在先申请：2022110603298提出了一种恒温层析核酸检测装置及检测方法，其要求：
[0007]1)扩增指标：恒温扩增温度控制在40℃左右且时间指标控制在10分钟；
[0008]2)初阳人员能够检测出来：灵敏度控制指标中的扩增体系内的样本在200copies/mL能够检测出来。
[0009]申请人在Himmpat中检索“层析and ORF1ab and内参”，得到以下结果：
[0010]现有技术1：CN112646929A。
[0011]现有技术2：CN113186346A。
[0012]现有技术3：CN112981008A。
[0013]现有技术4：CN112899402A。
[0014]现有技术5：CN111455099A。
[0015]上述现有技术均采用了“恒温扩增+胶体金层析试纸”的方式来完成检测，但是其无法满足扩增指标要求(普遍性的要求在20min以上)，而在灵敏度指标上，虽然均宣称检测
下限能够达到100copies/mL。然而，申请人在重复上述文献的试验时，对于ORF1ab基因+内参基因的检测，灵敏度一般在800～1400copies/ml。
[0016]综上所述，研发一款能够达到前述扩增、灵敏度要求的引物、探针、层析试纸，是一个亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0017]本申请的第一目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种双联核酸检测层析试纸。
[0018]本申请的第二目的在于提供一种引物及探针组，特别是一种ORF1ab基因、内参RnaseP基因检测的引物及探针组。
[0019]本申请的第三目的在于提供一种试剂盒。
[0020]本申请的技术方案是：
[0021]一种双联核酸检测层析试纸，包括PVC底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫；沿着层析溶液的流动方向，样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上；
[0022]检测垫上设置有硝酸纤维素膜，在检测垫上设置三个功能区：T1、T2、C区；
[0023]检测垫的T1区经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成；检测垫的T2区经由链霉亲和素加载在硝酸纤维素膜上形成；检测垫的C区经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成；
[0024]所述结合垫包含：FAM抗体
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显色颗粒复合物、DNP
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显色颗粒复合物，所述检测FAM抗体
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显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成；所述DNP
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显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成；
[0025]进一步，所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成；所述检测链霉亲和素是由链霉亲和素与磷酸缓冲液组成；DNP抗体由DNP多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。
[0026]进一步，样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫相邻的两种结构的重合长度在1mm。
[0027]进一步，显色颗粒为红色乳胶微球，所述乳胶微球粒径为400nm。
[0028]进一步，所述的双联核酸检测层析试纸制备时，包括以下步骤：
[0029]第一步骤，制备显色颗粒溶液，将显色颗粒溶液与FAM抗体混合反应形成FAM抗体
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显色颗粒复合物，将显色颗粒溶液与DNP混合反应形成DNP
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显色颗粒复合物；将FAM抗体
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显色颗粒复合物、DNP
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显色颗粒复合物加载到结合垫上；
[0030]第二步骤，抗地高辛抗体、链霉亲和素和DNP抗体分别加载在检测垫上的T1区、T2区和C区；
[0031]第三步骤，制备试纸大板，结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上，结合垫与检测垫部分重合，吸水垫与检测垫部分重合；
[0032]第四步骤，制备试纸条，将步骤三中制备的试纸大板进行裁切，制备成检测试纸。
[0033]进一步，所述的双联核酸检测层析试纸的检测方法为：
[0034]若有2019
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nCoV病毒，且采样合格其ORF1ab基因及内参基因在经过扩增体系后会产生扩增产物；扩增产物首先与样品垫结合，然后经过结合垫，其在经过结合垫时，两种扩增产物的FAM标签与FAM抗体
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显色颗粒复合物结合；
[0035]再经过检测垫：经过检测区时，ORF1ab基因扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使检测区T1显色；内参基因扩增产物的另一端Biotin标签会和检测区的链霉亲和素结合使检测区T2显色；
[0036]经过对照区，溶液在经过结合垫时，必然会混入DNP
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显色颗粒复合物，溶液在层析试纸流动的时候，经过对照区时，DNP
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显色颗粒复合物会与DNP抗体结合，对照区显色；
[0037]层析试纸会产生如下八种情况：
[0038]T1线显色、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双联核酸检测层析试纸，包括PVC底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫；沿着层析溶液的流动方向，样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上；其特征在于，检测垫上设置有硝酸纤维素膜，在检测垫上设置三个功能区：T1、T2、C区；检测垫的T1区经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成；检测垫的T2区经由链霉亲和素加载在硝酸纤维素膜上形成；检测垫的C区经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成；所述结合垫包含：FAM抗体
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显色颗粒复合物、DNP
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显色颗粒复合物，所述检测FAM抗体
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显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成；所述DNP
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显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成。2.根据权利要求1所述的一种双联核酸检测层析试纸，其特征在于，所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成；所述检测链霉亲和素是由链霉亲和素与磷酸缓冲液组成；DNP抗体由DNP多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。3.根据权利要求1所述的一种双联核酸检测层析试纸，其特征在于，样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫相邻的两种结构的重合长度在1mm。4.根据权利要求1所述的一种双联核酸检测层析试纸，其特征在于，显色颗粒为红色乳胶微球，所述乳胶微球粒径为400nm。5.根据权利要求2所述的一种双联核酸检测层析试纸，其特征在于，，所述的双联核酸检测层析试纸制备时，包括以下步骤：第一步骤，制备显色颗粒溶液，将显色颗粒溶液与FAM抗体混合反应形成FAM抗体
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显色颗粒复合物，将显色颗粒溶液与DNP混合反应形成DNP
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显色颗粒复合物；将FAM抗体
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显色颗粒复合物、DNP
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显色颗粒复合物加载到结合垫上；第二步骤，抗地高辛抗体、链霉亲和素和DNP抗体分别加载在检测垫上的T1区、T2区和C区；第三步骤，制备试纸大板，结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上，结合垫与检测垫部分重合，吸水垫与检测垫部分重合；第四步骤，制备试纸条，将步骤三中制备的试纸大板进行裁切，制备成检测试纸。6.根据权利要求1所述的一种双联核酸检测层析试纸，其特征在于，所述的双联核酸检测层析试纸的检测方法为：若有2019
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nCoV病毒，且采样合格其ORF1ab基因及内参基因在经过扩增体系后会产生扩增产物；扩增产物首先与样品垫结合，然后经过结合垫，其在经过结合垫时，两种扩增产物的FAM标签与FAM抗体
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显色颗粒复合物结合；再经过检测垫：经过检测区时，ORF1ab基因扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使检测区T1显色；内参基因扩增产物的另一端Biotin标签会和检测区的链霉亲和素结合使检测区T2显色；经过对照区，溶液在经过结合垫时，必然会混入DNP
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显色颗粒复合物，溶液在层析试纸流动的时候，经过对照区时，DNP
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显色颗粒复合物会与DNP抗体结合，对照区显色；层析试纸会产生如下八种情况：T1线显色、T2线显色、C线显色，表示ORF1ab检测结果阳性，采样合格结果有效；T1线显色、T2线不显色、C线显色，表示采样无效，需重新采样；
T1线不显色、T2线显色、C线显色，表示ORF1ab检测结果阴性，采样合格结果有效；T1线不显色、T2线不显色、C线显色，表示采样无效，需重新采样；T1线显色、T2线显色、C线不显色，表示采样无效，需重新采样；T1线显色、T2线不显色、...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏爱琪，陈新利，傅明华，李美琼，聂晶，
申请(专利权)人：江苏迅睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：