一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法，其中，裂解结合液由以下成分组成：10

【技术实现步骤摘要】
一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法


[0001]本专利技术涉及医疗领域，特别是一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法。

技术介绍

[0002]随着分子生物学技术的发展与革新，基于核酸信息的分子诊断技术日益成为人类日常生活中诊断疾病的重要手段，因而，对分子诊断必须步骤——核酸提取的要求也不断提高。
[0003]传统的核酸提取技术因其步骤繁琐、耗时长、难以自动化操作、且其中含有苯酚等有毒物质直接侵害操作人员的健康等弊端而逐渐被离心柱法、磁珠法等以固相吸附物载体为基础的新方法所取代。
[0004]离心柱法因其核酸提取效率低、成本高，且需要高速离心机，也难于实现自动化，亦不能广泛适用于大规模的临床检测。磁珠法是以磁性复合微球为载体特异性吸附核酸，洗涤液洗去非特异性吸附的蛋白质等杂质，最后用洗脱液并在磁场条件下从磁珠上洗脱并富集核酸，因其结果重复性好、稳定性高、操作简单、适用于自动化操作等优点而成为一种非常有前景的提取方法。但因为其提取效率不佳，纯度较低，提取时间长且含有高浓度胍盐等问题，磁珠法核酸提取的应用受到一定的限制。因此，为了解决上述问题，本专利技术提出一种新的核酸快速提取裂解液。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决上述问题，设计了一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法。
[0006]实现上述目的本专利技术的技术方案为，一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法，本专利技术旨在基于磁珠法核酸提取的基础上，提供一种能够快速地对生物样本中病原体核酸进行提取，且不含盐酸胍、硫氰酸胍等胍盐剧毒物质的裂解结合液。具体由以下试剂组成：10
‑
100mM缓冲液、20
‑
500mM乙二胺四乙酸、0.5
‑
5M无机盐、0.5
‑
5M尿素、0.1%
‑
1%表面活性剂、10%
‑
40%醇。
[0007]优选地，所述裂解结合液的无机盐离子选自NaCl、NaI、KCl、NaAc或柠檬酸钠的一种或多种。
[0008]优选地，所述裂解结合液的缓冲液选自Tris
‑
HCl、HEPES或NaAc
‑
HAc的一种。
[0009]优选地，所述裂解结合液的表面活性剂选自TritonX
‑
100、Tween20、Tween80、SDS、NP
‑
40中的一种或多种。
[0010]优选地，所述裂解结合液的醇选自乙醇、异丙醇、异戊醇或十一醇的一种。
[0011]进一步地，所述裂解结合液还包括含量为10
‑
50mg/mL、粒径300
‑
800nm的羧基磁性纳米微球。
[0012]进一步地，所述裂解结合液的pH值范围在6
‑
6.5之间。
[0013]进一步地，所述裂解结合液由灭菌的DEPC
‑
H2O配置。
[0014]本试剂盒对生物样本中病原体核酸提取步骤如下：Step1：将上述裂解结合液、待测样本、蛋白酶K和磁珠依次加入离心管中，涡旋振荡混匀1min后，置于磁力架上吸附磁珠，弃去上清液。
[0015]Step2：将洗涤液Ⅰ加入上述离心管中，涡旋振荡混匀后立即置于磁力架上吸附磁珠，弃去上清液。
[0016]Step3：将洗涤液Ⅱ加入上述离心管中，涡旋振荡混匀后立即置于磁力架上吸附磁珠，弃去上清液。
[0017]Step4：将洗脱液加入上述离心管中，涡旋振荡混匀后置于金属浴中加热洗脱核酸。
[0018]Step5：将上述离心管置于磁力架吸附磁珠，转移上清液至新的离心管中以待备用。
[0019]利用本专利技术的技术方案制作的一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法，（1）提取效率高：本专利技术裂解结合液对样本进行边裂解、边吸附，减少了操作步骤，提高了样本核酸提取效率。（2）毒性小：本专利技术裂解结合液不含有盐酸胍、硫氰酸胍等胍盐，通过高浓度无机盐对样本中病原体进行裂解、低pH环境促进核酸与磁珠的结合。（3）产物纯度高：通过调整裂解结合液、洗涤液中的盐浓度和pH值，降低了杂质的非特异性结合。（4）可自动化操作：本专利技术匹配多种自动化核酸提取仪，提取32个样本的时间仅为8min，能广泛且快速适用于大规模的临床样本提取。
附图说明
[0020]图1为实例1中以人唾液/血清/血浆+DNA/RNA病毒（ADV1/H1N1）为样本提取图；图2为实例1中以人唾液/血清/血浆+DNA/RNA病毒（ADV1/H1N1）为样本提取图；图3为实例3中以人唾液/血清/血浆+DNA/RNA病毒（ADV1/H1N1）为样本，以人工提取和机器提取后的PCR扩增示意图；图4为实例3中以人唾液/血清/血浆+DNA/RNA病毒（ADV1/H1N1）为样本，以人工提取和机器提取后的PCR扩增示意图；图5为实例4的结构示意图；图6为实例4中的局部俯视结构示意图；图中：1、试剂盒；2、密封盖；3、锥柱形啮合头；4、上啮合环；5、下啮合环；6、上环槽；7、下环槽；8、六楞面；9、流液孔。
具体实施方式
[0021]实施例1：本方案以人唾液/血清/血浆+DNA/RNA病毒（ADV1/H1N1）为样本，进行临床样本模拟，以证本专利技术的裂解结合液、试剂盒及提取方法可以对人唾液、血清、血浆中DNA和RNA病原体核酸进行高质量提取，从而达到为临床样本病原体检测奠定快速、高质量的基石。
[0022]本试验所需仪器设备：生物安全柜、金属浴、掌上离心机、磁力架、PCR仪。
[0023]实验组：依次将180μL唾液/血清/血浆、20μL2000copies/mL的ADV1/H1N1病毒、20μL蛋白酶K、500μL所述裂解结合液、20μL磁珠于1.5mL离心管内，上下颠倒混匀后置于室温下裂解1min；置于磁力架上吸磁，弃去管内液体；加入1mL洗涤液Ⅰ，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入1mL洗涤液2，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入50μL洗脱液，涡旋混匀后置于80℃金属浴洗脱2min。
[0024]本试验所需仪器设备：生物安全柜、金属浴、掌上离心机、磁力架、PCR仪。
[0025]实例1结果：结果如表1所示表1.实例1结果样本Ct值A260/280ꢀ样本Ct值A260/280唾液+ADV122.411.88唾液+H1N120.942.02血清+ADV122.431.87血清+H1N120.631.98血浆+ADV122.141.87血浆+H1N121.951.98结果说明：本专利技术的裂解结合液、试剂盒及提取方法可以对人唾液、血清、血浆中DNA和RNA病原体核酸进行高质量提取。
[0026]实施例2：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生物样本中病原体核酸提取的裂解结合液，其特征在于，由以下试剂组成：10
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100mM缓冲液、20
‑
500mM乙二胺四乙酸、0.5
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5M无机盐、0.5
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5M尿素、0.1%
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1%表面活性剂、10%
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40%醇，余量为DEPC
‑
H2O；所述裂解结合液还包括10
‑
50mg/mL、粒径300
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800nm的羧基磁性纳米微球。2.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中病原体核酸提取的裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液的无机盐离子选自NaCl、NaI、KCl、NaAc或柠檬酸钠的一种或多种。3.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中病原体核酸提取的裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液的缓冲液选自Tris
‑
HCl、HEPES或NaAc
‑
HAc的一种。4.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中病原体核酸提取的裂解结合液，其特征在于，所述裂解结合液的表面活性剂选自TritonX
‑
100、Tween20、Tween80、SDS、NP
‑
40中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中病原体核酸提取的裂解结合液，其特征在于，所述裂...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅明华，李美琼，郭志强，聂晶，
申请(专利权)人：江苏迅睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：