一种从软骨组织中提取RNA的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学检测技术领域，公开一种从软骨组织中提取RNA的方法。所述的方法包括如下步骤：1)软骨组织粉末、CTAB裂解液、β

【技术实现步骤摘要】
一种从软骨组织中提取RNA的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种从软骨组织中提取RNA的方法。

技术介绍

[0002]骨组织坚硬，骨细胞密度低，外周基质中含有大量的粘蛋白(蛋白聚糖)和RNA，难以分离。传统的抽提方案方法无法提取高质量的总RNA。但是，随着分子生物学的高速发展，基因组测序、遗传分析等研究也被广泛应用和推广。这些往往需要基于高纯度和高完整度的RNA，对RNA的质量便有了更高的要求。
[0003]目前对于总RNA提取方法有异硫氰酸胍/酚法(trizol法)(CN107699559A)、SDS法、CTAB法(CN104017804A)和提取试剂盒(CN106434633A)等。但是由于骨骼样本的特殊性，采用一般的抽提方法很难获取高纯度、高产率、完整性好和盐离子浓度低的RNA，特别是高纯度和完整性好的RNA。
[0004]目前，骨组织就是由于未能有效地分离纯化其中的RNA，从而阻碍了其分子生物学方面的研究进展。因此，很有必要针对骨组织的特性，对RNA的提取方法进行优化和改进，找到一种较为简便、快速、通用和高效的骨组织总RNA提取方法。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种从软骨组织中提取RNA的方法，以期解决现有技术中存在的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术具体采用如下技术方案。
[0007]本专利技术的第一方面保护一种从软骨组织中提取RNA的方法，包括如下步骤：
[0008]1)软骨组织粉末、CTAB裂解液、β
‑
巯基乙醇和蛋白酶K进行孵育；
[0009]2)固液分离，取上清液，与酚氯仿混合；
[0010]3)固液分离，取上清液，与乙醇混合；
[0011]4)固液分离，取沉淀，洗涤；
[0012]5)固液分离，取沉淀，与溶剂混合，得到所述的RNA。
[0013]在本专利技术的某些实施方式中，所述的CTAB裂解液包含0.5％～4wt％的CTAB、0.5～4.5M的NaCl、50～400mM的Tris
‑
HCl和50～200mM的EDTA。本专利技术中Tris
‑
HCl提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏，有利于RNA的稳定；EDTA能螯合Mg
2+
和Mn
2+
，抑制RNase活性，防止RNA被降解；0.5～4.5M NaCl提供一个高盐环境，使RNP(RNA
‑
CTAB complex)充分溶解，存在于液相中；CTAB能溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离，在高盐溶液中核酸是可溶的。
[0014]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的CTAB裂解液可以包含0.5％～1.2wt％的CTAB，也可以包含1％～2.5wt％的CTAB，也可以包含2.3％～4wt％的CTAB。在某个优选的实施方式中，包含2wt％的CTAB。
[0015]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的CTAB裂解液可以包含0.5～1.8M的NaCl、
也可以包含1.5～3.6M的NaCl，也可以包含3.3～4.5M的NaCl。在某个优选的实施方式中，包含1.5M的NaCl。
[0016]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的CTAB裂解液可以包含50～180mM的Tris
‑
HCl、也可以包含150～350M的Tris
‑
HCl，也可以包含300～400M的Tris
‑
HCl。在某个优选的实施方式中，包含200M的Tris
‑
HCl。
[0017]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的CTAB裂解液可以包含50～100mM的EDTA、也可以包含80～150mM的EDTA，也可以包含100～200mM的EDTA。在某个优选的实施方式中，包含100mM的EDTA。
[0018]在本专利技术的某个优选的实施方式中，所述的CTAB裂解液包含2wt％的CTAB、1.5M的NaCl、200mM的Tris
‑
HCl和100mM的EDTA。
[0019]在本专利技术的某些实施方式中，所述的CTAB裂解液的pH值为7.0～9.0。
[0020]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的CTAB裂解液的pH值可以为7.0～8.2，也可以为7.5～8.6，也可以为8.4～9.0。在某个优选的实施方式中，为8.0。
[0021]在本专利技术的某些实施方式中，所述的软骨组织粉末和CTAB裂解液的质量体积比为1mg：(1～20)μL。
[0022]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的软骨组织粉末和CTAB裂解液的质量体积比可以为1mg：(1～9)μL，也可以为1mg：(8～15)μL，也可以为1mg：(12～20)μL。在某个优选的实施方式中，为1mg：10μL。
[0023]在本专利技术的某些实施方式中，所述的软骨组织粉末和蛋白酶K的质量比为100mg：(0.0001～0.002)U。本专利技术中蛋白酶K能消化骨组织外周基质中的粘蛋白，辅助裂解，释放被粘蛋白包裹的RNA。
[0024]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的软骨组织粉末和蛋白酶K的比例可以为100mg：(0.0001～0.001)U，也可以为100mg：(0.0005～0.0015)U，也可以为100mg：(0.0014～0.002)U。在某个优选的实施方式中，为1mg：0.0004U。
[0025]在本专利技术的某些实施方式中，所述的CTAB裂解液和β
‑
巯基乙醇的体积比为100：(0.2～5)。本专利技术中β
‑
巯基乙醇能作为抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
[0026]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的CTAB裂解液和β
‑
巯基乙醇的体积比为100：(0.2～1.6)，也可以为100：(1.2～3.4)，也可以为100：(2.2～5)。在某个优选的实施方式中，为100：2。
[0027]在本专利技术的某些实施方式中，1)中，所述的孵育温度为40～70℃。
[0028]在本专利技术的某些具体实施方式中，1)中，所述的孵育温度可以为40～55℃，也可以50～60℃，也可以为58～70℃。在某个优选的实施方式中，为50℃、55℃、60℃。
[0029]在本专利技术的某些实施方式中，1)中，所述的孵育时间为5～30min。
[0030]在本专利技术的某些具体实施方式中，1)中，所述的孵育时间可以为5～15min，也可以为10～19min，也可以为18～30min。在某个优选的实施方式中，为10min、15min和20min。
[0031]在本专利技术的某些实施方式中，2)中，所述的酚氯仿为水饱和酚和氯仿的混合物。
[0032]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述的水饱和酚和氯仿的体积比为(0.5～1.5)：1。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从软骨组织中提取RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)软骨组织粉末、CTAB裂解液、β
‑
巯基乙醇和蛋白酶K进行孵育；2)固液分离，取上清液，与酚氯仿混合；3)固液分离，取上清液，与乙醇混合；4)固液分离，取沉淀，洗涤；5)固液分离，取沉淀，与溶剂混合，得到所述的RNA。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CTAB裂解液包含0.5～4wt％的CTAB、0.5～4.5M的NaCl、50～400mM的Tris
‑
HCl和50～200mM的EDTA；和/或，所述的CTAB裂解液的pH值为7.0～9.0。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：A1)所述的软骨组织粉末和CTAB裂解液的质量体积比为1mg：(1～20)μL；A2)所述的软骨组织粉末和蛋白酶K的比例为100mg：(0.0001～0.002)U；A3)所述的CTAB裂解液和β
‑
巯基乙醇的体积比为100：(0.2～5)。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桃，董亚晨，李震，
申请(专利权)人：上海美吉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：