一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法技术

本申请提供了一种固相萃取结合HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法


[0001]本专利技术涉及化妆品检验
，尤其涉及一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法。

技术介绍

[0002]人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor，hEGF，Cas No:62253
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63
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8)是由53个氨基酸组成的、相对分子量为6224Da的小分子多肽，其多肽链上N
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端为天冬酰酸，C
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端为精氨酸，等电点为4.6。hEGF分子对酸、碱、热等均具有较高的稳定性。
[0003]近年来hEGF被尝试用于化妆品，以改善皮肤问题，hEGF在化妆品中的作用主要表现在护肤、修护、抗皱、防衰老、美白、祛斑、防晒及晒后修复、抑制粉刺和青春痘生长、去除斑痕，护发、养发等。正因为hEGF对皮肤有显著的生物活性，市场上含hEGF的化妆品也日益增多。
[0004]然而，hEGF在护肤品中的应用却是有风险的，它会导致肌肤组织过度生长，贸然使用还有可能导致皮肤生长不可控，形成“肿瘤”样结节增生。
[0005]2019年1月10日，国家药品监督管理局发布的消费警示指出“不同于寡肽
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1，人寡肽
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1(hEGF)不得作为化妆品原料使用。在配方中添加或者产品宣称含有人寡肽
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1或hEGF的，均属于违法产品”。然而，在日常化妆品监督抽检工作中发现市售宣称含有hEGF，或以寡肽名义标注实际含有hEGF的化妆品现象严重，而我国并没有出台相应化妆品中hEGF的检测方法。
[0006]由于hEGF分子量大、易溶于水，对其准确分析带来了极大的难度，增加了样品制备的难度，常规的检测方法也难以用于此物质的测定。
[0007]目前，国内外关于检测化妆品中人表皮生长因子的方法有少量报道，主要有吴震等运用酶联免疫法快速筛查化妆品中非法使用人表皮生长因子，在筛查36份化妆品中发现有6份为阳性，其中3份冻干粉、2份水剂和1份啫喱，其应用化妆品基质种类少、易受基质干扰、灵敏度低、假阳性率高，且不能测定具体数值；后来吴震等又通过HPLC分离，在二极管阵列检测器检测建立了利用高效液相色谱法测定化妆品中非法使用人表皮生长因子的方法，该方法能测定具体值，且准确度较ELISA法高，但抗干扰能力差、灵敏度低，容易产生假阳性结果。
[0008]因此，建立一种灵敏、准确、可靠的测定化妆品中人表皮生长因子的分析方法非常有必要。

技术实现思路

[0009]针对上述问题，现提供一种快速、高效、灵敏的化妆品中人表皮生长因子的测定方法。
[0010]具体技术方案如下：
[0011]一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法，具有这样的特征，包括如下步骤：
[0012]1)样品前处理：称取样品，加入二氯甲烷，涡旋使其充分混匀，再加入提取液，涡旋提取、离心，取上清液待净化；
[0013]2)标准储备液和中间液的配制：准确称取适量的hEGF标准品，用50％乙腈水溶液溶解并定容成浓度为50μg/mL的标准储备液，于
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20℃避光保存；将标准储备液用水逐级稀释浓度分别为1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL的混合标准中间液；
[0014]3)基质匹配标准工作液的配制：移取标准中间液，用不含待测物的化妆品处理液稀释成浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL的基质匹配标准工作液；
[0015]4)样品分析检测：利用高效液相色谱
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三重四级杆质谱法对基质匹配标准工作液进行测定，绘制标准曲线；再在相同参数下待测溶液进行检测，获得试样中hEGF的质量色谱图，以保留时间和离子比率对目标物进行定性分析，以质量色谱图的峰面积和线性回归方程，计算得到待测物的浓度；
[0016]其中，液相色谱串联谱法中流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；线性梯度洗脱中流动相A+流动相B＝100％，线性梯度洗脱条件为：0
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1.5min，5.0％B；1.5
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4.5min，5.0
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40.0％B；4.5
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6min，40.0
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95.0％B；6
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9min，95.0％；9.0
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9.1min，95.0
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5.0％B；9.1
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11min，5.0％B。
[0017]上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤1)中样品前处理方法为：称重1.0g化妆品，置至10mL聚丙烯离心管中，添加1.0mL二氯甲烷，涡旋使其充分混匀，添加5.0mL 5％氨水，再剧烈旋转10min后以3900rpm的转速离心3min，将上清液过以3.0mL甲醇和3.0mL水活化好的Oasis MAX(60mg/3mL)固相萃取小柱，控制样品溶液滴落速度为1滴/s，分别用3.0mL、5％氨水和3.0mL、5％甲醇水溶液淋洗小柱，负压抽干，再用2
×
0.25mL的10％甲酸75％乙腈水溶液分两次洗脱并完全接收，涡旋混匀后过0.22μm尼龙滤膜于聚丙烯小瓶中，再取5μL滤液注入HPLC
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MS/MS系统。
[0018]上述的测定方法，还具有这样的特征，步骤4)中标准曲线绘制方法为：以高效液相色谱
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串联质谱仪对浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL的标准工作溶液进行检测，获得标准溶液的质量色谱图，以峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。
[0019]上述的测定方法，还具有这样的特征，质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为正离子模式扫描；幕气气压为35psi；离子源气体为GS1、60psi；离子源气体为GS2、60psi；离子喷射电压为5500V；源温度为600℃；碰撞气体为氮气。
[0020]上述的测定方法，还具有这样的特征，质谱条件为：色谱柱为Luna Omega PS C18(100mm
×
2.1mm，1.6μm)柱；进样体积为5μL；柱温为40℃；流速为0.4mL/min。
[0021]化妆品样品基质原料主要是油性原料，包括油脂类、蜡类、碳氢化合物以及组成这些成分的高级脂肪酸、高级醇类，上述基质会干扰分析物的测定。针对上述问题，本专利技术首次采用Oasis MAX固相萃取小柱对化妆品样品进行净化，协同特定的前处理工艺，从而提供了一种操作简单且准确度高的快速测定方法。
[0022]本专利技术采用具有独特的硅胶表面正电荷修饰的色谱柱进行化妆品中人表皮生长因子的分离分析，在流动相添加适量甲酸，有利于提高质谱离子化效率，进而提高质谱分析的灵敏度。本专利技术检出限为0.75μg/kg，定量限为2.5μg/kg，完全满足对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种化妆品中人表皮生长因子的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：1)样品前处理：称取样品，加入二氯甲烷，涡旋使其充分混匀，再加入提取液，涡旋提取、离心，取上清液待净化；2)标准储备液和中间液的配制：准确称取适量的hEGF标准品，用50％乙腈水溶液溶解并定容成浓度为50μg/mL的标准储备液，于
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20℃避光保存；将标准储备液用水逐级稀释浓度分别为1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL的标准中间液；3)基质匹配标准工作液的配制：移取标准中间液，用不含待测物的化妆品处理液稀释成浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL的基质匹配标准工作液；4)样品分析检测：利用高效液相色谱
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三重四级杆质谱法对基质匹配标准工作液进行测定，绘制标准曲线；再在相同参数下待测溶液进行检测，获得试样中hEGF的质量色谱图，以保留时间和离子比率对目标物进行定性分析，以质量色谱图的峰面积和线性回归方程，计算得到待测物的浓度；其中，高效液相色谱串联谱法中流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；线性梯度洗脱中流动相A+流动相B＝100％，线性梯度洗脱条件为：0
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1.5min，5.0％B；1.5
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4.5min，5.0
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40.0％B；4.5
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6min，40.0
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95.0％B；6
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9min，95.0％；9.0
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9.1min，95.0
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5.0％B；9.1
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11min，5.0％B。2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨明，江小明，杨永，涂凤琴，伊鋆，卢跃鹏，方慧文，
申请(专利权)人：武汉食品化妆品检验所，
类型：发明
国别省市：