用于食用油、厨房油烟和汽车尾气中苯并芘的酶联免疫检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于食用油、厨房油烟和汽车尾气中苯并芘的酶联免疫检测试剂盒，包括：样本复溶液、酶结合物/抗体稀释液、标准品/样本稀释液、苯并芘标准品、苯并芘特异性鼠单克隆抗体、酶结合物、包被有苯并芘抗原的酶标孔板、显色液、终止液、洗涤液。本发明专利技术还公开了使用所述试剂盒检测食用油、厨房油烟和汽车尾气中苯并芘的方法，包括待测样本前处理、酶联免疫检测、结果处理与分析。本发明专利技术提供的样本复溶液、酶结合物/抗体稀释液、标准品/样本稀释液，在保持抗体灵敏度不变的情况下，克服了食用油、厨房油烟和汽车尾气中苯并芘溶解度的问题，还可以显著提高抗体的效价，具有重要的推广应用价值。推广应用价值。推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
用于食用油、厨房油烟和汽车尾气中苯并芘的酶联免疫检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及一种用于检测油脂中苯并芘的酶联免疫试剂盒，其特别适用于食用油、厨房油烟、汽车尾气等含油脂成分的样品中苯并芘的检测。

技术介绍

[0002]苯并芘，为含苯环的稠环芳烃化合物之一，具有强致癌性。根据苯环的稠合位置不同，苯并芘有多种异构体，常见的有两种是，一种是苯并[a]芘，有致癌性；另一种苯并[e]芘，有强致癌性。一般是由于生产和生活中石油、煤、天然气等燃料的不完全燃烧或者是有机质的高温分解产生，与其他多环芳烃化合物一起广泛的存在于环境中，如空气、水、土壤及沉积物、熏制食物、烧烤和煎炸食物中，汽车尾气也会排放苯并芘到空气中去。目前，作为多环芳烃中毒性最大的一种致癌物质，国家对空气、食品、食用油、油烟以及排放物中苯并芘的限量标准有明确的规定，对其进行严格的监管和控制。因此，对空气、食品、食用油、油烟进行苯并芘含量检测对人类健康极其重要。
[0003]目前，针对食用油中苯并芘的检测，基本上都是采用仪器方法：气相色谱
‑
质谱法、高效液相色谱法、液相色谱
‑
荧光检测法。这些检测方法需要大型且昂贵的设备，且操作过程相对复杂，耗时长，需要消耗大量有毒的有机试剂，如二氯甲烷，容易产生大量的有毒废液，因此需要设施较为齐备的实验室才能进行油脂中苯并芘的检测。用于测定苯并芘的方法还有酶联免疫吸附分析法，是一种将抗原
‑
抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合形成的一种综合性技术，具有特异性好，灵敏度高，操作简便快捷的优点。但市面上商品化的苯并芘快检产品较少，绝大多数产品适用范围单一，仅仅适用于水样这种基质成分简单的样本，且检测时间长，前处理除外，检测时长都在1.5小时以上，不适合对大量样品的快速分析和检测。针对食用油这种基质复杂的样本，尚无稳定、快速、可靠的快速检测产品。这是因为苯并芘为5个苯环共面的一个平面刚性结构，为非极性分子，不溶于水，但是非常易溶于食用油中，因此，食用油中苯并芘的检测面临着以下难点：提取净化较为困难；酶联免疫吸附测定、免疫层析检测等免疫检测方法，均需要用到抗原抗体，反应需在水相中进行，因此面临苯并芘难溶于水导致反应灵敏度差，为了解决这一问题，需在体系中引入有机试剂且浓度相对较高；有机试剂的引入会影响快检试剂的稳定性；试剂盒必须配备标准品溶液，而苯并芘在水中不溶，因此需使用纯有机试剂当溶剂，临用前再稀释，否则会面临苯并芘从标准品溶液中析出并吸附在容器壁。
[0004]现有技术中，公开的CN105738611A提供了一种用于检测土壤和水中苯并芘残留的酶联免疫试剂盒，水样的基质成分比较简单，比较容易提取出苯并芘。又例如CN115028733A提供了一种水产品如鱼虾蟹中残留的芘和苯并芘的酶联免疫方法和试剂盒。然而，上述这些酶联免疫试剂盒在检测油脂中苯并芘时都面临如下难点：1)油脂的主要成分就是甘油三酯，会阻碍抗体与抗原之间的反应(在微孔表面或蛋白表面形成疏水层，阻碍抗原和抗体的结合或疏水基团插入蛋白内部导致蛋白构象改变)；2)油脂中色素、维生素、萜类化合物等
对抗原抗体反应的影响；3)餐厨回收油以及反复煎、炸后的油，由于易引入其他食源性成分，基质成分更复杂；4)对苯并芘溶解性好的有机试剂往往与油脂混溶。同时，上述试剂盒都是针对水样、土壤或者水产品的苯并芘含量的检测，针对油脂中苯并芘的酶联免疫检测缺少研究。苯并芘非常易溶于油脂中，对于食用油、厨房油烟、汽车尾气这类样品不易检测其中的苯并芘含量，这成为了油脂中苯并芘的主要检测难点。因此，如何在兼顾效率、成本、灵敏度以及环境友好的前提下，从油中有效地分离净化苯并芘，剔除上述这些杂质对酶联免疫检测的影响成为了免疫快检方法的一大障碍。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服苯并芘易溶于油脂、难溶于水的问题，针对检测食用油中残留的苯并芘开发出了一种稳定、快速、简便、高灵敏度的酶联免疫定量检测试剂盒，本专利技术不受实验室设备条件的限制，能够实现随时随地对油脂中的苯并芘进行快速检测。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种快速检测食用油中苯并芘的定量的方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下测定原理：通过酶标板孔内的抗原与样品中的待测物相互竞争与加入的苯并芘抗体结合，通过洗涤后，洗去未结合的苯并芘抗体，留下抗原
‑
苯并芘抗体的结合物，经酶结合物反应后，再加入底物显色。而抗原和抗体的量是一定的，若样品中待测物浓度越高，则与抗体结合的就越多，与酶标板上抗原结合的抗体就越少，发色反应也就越弱，标准品/样品中苯并芘含量与其吸光度呈负相关。通过一系列已知浓度的苯并芘标准品与其吸光度建立浓度与吸光度的log
‑
logit标准曲线，代入待测样本吸光度，即可求出待测样品中苯并芘的浓度。另外，由于反应需在水相中进行，本专利技术为了既能解决苯并芘的溶解度问题，同时保持较高的灵敏度，采用了甲醇复溶液进行复溶，并在酶结合物/抗体稀释液中加入甘油、海藻糖、山梨醇和在标准品/样本稀释液加入Mg
2+
、柠檬酸钠，有效保持了抗体和酶结合物等核心组分的稳定性，增加了苯并芘的溶解度及维持在水溶液中的稳定，同时通过改变并维持抗体的优势构象(在溶液中存在游离苯并芘时，抗体优先与其反应；而溶液中无待测物时，则保持抗体与微孔上抗原的结合性能)。为了实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0008]本专利技术提供的酶联免疫试剂盒包括以下组分：
[0009](1)酶结合物/抗体稀释液；
[0010](2)标准品稀释液、样本稀释液；
[0011](3)样本复溶液
[0012]所述酶联免疫检测试剂盒的组分还包括苯并芘标准品、苯并芘特异性鼠单克隆抗体、酶结合物、包被有苯并芘抗原的酶标孔板、显色液、终止液、洗涤液。
[0013]所述酶结合物/抗体稀释液的配方为：20mmol/L的磷酸缓冲液、5％v甘油、1wt％海藻糖、2％wt山梨醇、0.1％wt防腐剂，还含有0.1wt％SG09或0.1wt％BSA，pH值为7.4。
[0014]所述标准品稀释液配方为：50v％甲醇水溶液、40
‑
332.5nmol/LMg
2+
(一般情况下可以选用硫酸镁，通过换算硫酸镁在标准品稀释液的浓度为0.05
‑
0.4wt％)、0.05
‑
2wt％柠檬酸钠；所述样本稀释液配方为：40
‑
665nmol/LMg
2+
(一般情况下可以选用硫酸镁，通过换算硫酸镁在标准品稀释液的浓度为0.05
‑
0.8wt％)、0.05
‑
4wt％柠檬酸钠。
[0015]所述各配方中的v％为体积百分数，wt％为质量百分数。
[0016]优选地，所述防腐剂为proclin 950。
[0017]优选地，所述标准品稀释液配本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测食用油、厨房油烟和汽车尾气中苯并芘的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本复溶液、酶结合物/抗体稀释液、标准品稀释液、样本稀释液；所述样本复溶液为纯甲醇；所述酶结合物/抗体稀释液的配方为：5
‑
200mmol/L的磷酸缓冲液、0.5
‑
20v％甘油、0.5
‑
10wt％海藻糖、0.5
‑
10wt％山梨醇、0.01
‑
0.5v％防腐剂，还含有0.1
‑
1wt％SG09或0.001
‑
0.3wt％BSA，pH值为7.4；所述标准品稀释液为：50v％甲醇水溶液、40
‑
332.5nmol/LMg
2+
和0.05
‑
2wt％柠檬酸钠；所述样本稀释液为：40
‑
665nmol/LMg
2+
和0.05
‑
4wt％柠檬酸钠。2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物/抗体稀释液的配方中，甘油的浓度为5v％、海藻糖的浓度为1wt％、山梨醇的浓度为2wt％，还含有0.1wt％SG09或0.1wt％BSA，pH值为7.4。3.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液为50v％甲醇水溶液、80
‑
210nmol/LMg
2+
、0.5
‑
1.4wt％柠檬酸钠；所述样本稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员：李远兵，毛燕妮，聂懿，
申请(专利权)人：武汉食品化妆品检验所，
类型：发明
国别省市：