制备低分子量肝素的方法以及由此获得的低分子量肝素技术

本发明专利技术涉及一种获取具有高稳定性的低分子量肝素的方法。该方法包括使用H2O2处理解聚肝素，其中每千克解聚肝素使用0.04至1.0升质量浓度为33％的H2O2。本发明专利技术还涉及通过该方法获得的肝素。获得的肝素。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备低分子量肝素的方法以及由此获得的低分子量肝素


[0001]本专利技术涉及一种制备低分子量肝素(LMWH)的方法以及由此获得的低分子量肝素。

技术介绍

[0002]肝素是糖胺聚糖家族的一种多糖，由糖醛酸(L
‑
艾杜糖醛酸或D
‑
葡萄糖醛酸)和D
‑
葡萄糖胺交替结合而成。L
‑
艾杜糖醛酸可以被2
‑
O
‑
硫酸化，D
‑
葡萄糖醛酸可以被N
‑
硫酸化和/或6
‑
O
‑
硫酸化，并在较小程度上被N
‑
乙酰化或3
‑
O
‑
硫酸化。肝素在大多数情况下以钠盐形式使用，但也可以其他碱金属或碱土金属盐的形式使用，主要用作抗血栓和抗凝血药物。
[0003]根据分子量，肝素可被分为普通肝素(UFH)、LMWH和极低分子量肝素(VLMWH)。LMWH和VLMWH来自于原始UFH的解聚。
[0004]在现有技术内已描述了多种制备LMWH的方法。其中之一是通过β
‑
消除机制进行碱解聚。
[0005]EP0040144描述了一种通过包含以下步骤的方法获取LMWH的方法：将肝素盐转盐为肝素季铵盐，使肝素季铵盐与苄基氯进行酯化反应，纯化并获取肝素苄酯钠盐，使用氢氧化钠解聚，酯皂化并纯化产物。
[0006]EP1070503描述了一种通过包含以下步骤的方法获取LMWH的方法：将肝素盐转盐为苯扎氯铵肝素，在非水介质中使用Triton B解聚并纯化产物。
[0007]EP2881404描述了一种获取LMWH的方法，包括转盐，然后用磷苯碱或胍基衍生碱进行解聚，最后进行转盐。
[0008]需要更可重复且更稳定的方法来获取LMWH，特别是稳定性更好的LMWH。

技术实现思路

[0009]本专利技术的专利技术人发现了一种制备低分子量肝素(LMWH)的方法，通过该方法制备的产品不仅具备高稳定性，同时还保持了良好的抗FXa和抗FIIa活性。该LMWH的制备方法包括使用H2O2处理解聚肝素粗品，其中每千克解聚肝素中使用0.04至1.0升质量浓度为33％的H2O2。
[0010]因此，在第一方面，本专利技术涉及一种获取平均分子量在3至3.8KDa之间的低分子量肝素的方法，该方法包括以下步骤：
[0011]a)制备肝素钠水溶液；
[0012]b)向步骤a)的溶液中加入苯扎氯铵，获得苯扎氯铵肝素；
[0013]c)将步骤b)中获得的苯扎氯铵肝素溶于Cl2CH2中，添加Triton B并保持20至40℃的温度，持续24至48小时；
[0014]d)使用H2O2对步骤c)中获得的解聚肝素进行至少两次处理，每次处理中每千克解聚肝素使用0.04至1.0升质量浓度为33％的H2O2。
[0015]在第二方面，本专利技术涉及通过本专利技术的方法获得的低分子量肝素。
[0016]已发现在所获得的LMWH中，1,6
‑
脱水残基的含量在1％至15％之间。因此，在第三
方面，本专利技术涉及一种平均分子量在3至3.8KDa之间且寡糖链还原端1,6
‑
脱水残基含量在1％至15％之间的低分子量肝素。
[0017]针对一方面描述的定义和实施方案同样适用于本专利技术的其他方面。
[0018]在本专利技术中，“低分子量肝素”或“LMWH”应理解为《欧洲药典》第九版“肝素”下“低分子量肝素专论”0828(Heparins,Low
‑
Molecular
‑
Mass monograph,0828,European Pharmacopeia 9th Ed.)中所述的从肝素获得的多糖混合物，其平均分子量小于8,000道尔顿，且其总质量中至少60％的成分的分子量小于8,000Da。本专利技术中LMWH的平均分子量按照《欧洲药典》(第九版)中的方法测定。
[0019]在本专利技术中，“1,6
‑
脱水残基”应理解为在解聚过程中在LMWH末端产生的各种化学基团。这些基团包括但不仅限于2
‑
磺胺
‑
1,6
‑
脱水
‑2‑
脱氧
‑
β
‑
D
‑
吡喃葡萄糖(1,6
‑
脱水葡萄糖胺)和2
‑
磺胺
‑
1,6
‑
脱水
‑2‑
脱氧
‑
β
‑
D
‑
甘露糖(1,6
‑
脱水甘露糖胺)。该类残基在LMWH中的数量以还原端存在该类残基的寡糖链的百分比表示。
[0020]LMWH中1,6
‑
脱水残基末端的含量可通过《欧洲药典》第九版“依诺肝素钠专论”1097(Enoxaparin Sodium monograph,1097,European Pharmacopeia 9th Ed)提及的鉴定方法B中所述分析方法得出。在该方法中，使用肝素酶I、II和III的混合物对分子进行彻底解聚，分离并采用强阴离子交换色谱法(SAX
‑
HPLC)对产生的残基进行定量。例如，1,6
‑
脱水残基的含量根据以下公式确定：
[0021]％1,6
‑
脱水残基＝Mw
·
(A1+A2+A3)
·
100/ΣMw
x
·
A
x
[0022]其中：
[0023]‑
Mw表示平均分子量
[0024]‑
Mw
x
表示衍生物x的分子量(参见《欧洲药典》第九版“依诺肝素钠专论”1097表1097
‑
1(Enoxaparin Sodium monograph,1097,European Pharmacopeia 9th Ed))
[0025]‑
A
x
表示衍生物x的峰面积
[0026]‑
A1表示1,6
‑
脱水残基衍生物的峰面积ΔIS
[0027]‑
A2表示1,6
‑
脱水残基衍生物的峰面积ΔIIS
[0028]‑
A3表示1,6
‑
脱水残基衍生物的峰面积ΔIS
‑
IS
[0029]LMWH中1,6
‑
脱水葡萄糖胺残基和1,6
‑
脱水甘露糖胺残基的比例可通过核磁共振(NMR)，例如通过1H 13
C HSQC确定。这两种残基的比率可通过整合其各自在1H 13
C HSQC中相应的信号来确定。
[0030]本专利技术中LMWH的抗FXa和抗FIIa活性通过《欧洲药本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种获取平均分子量在3至3.8KDa之间的低分子量肝素的方法，所述方法包括以下步骤：a)制备肝素钠水溶液；b)向所述步骤a)的溶液中加入苯扎氯铵，获得苯扎氯铵肝素；c)将所述步骤b)中获得的苯扎氯铵肝素溶于Cl2CH2中，添加Triton B并保持20至40℃的温度，持续24至48小时；d)使用H2O2对所述步骤c)中获得的解聚肝素进行至少两次处理，每次处理中每千克解聚肝素使用0.04至1.0升质量浓度为33％的H2O2。其中所述步骤d)是在pH值为10.5至11.5之间的条件下进行的，优选地每次使用H2O2处理至少3小时。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤c)中加入Triton B通过最多三次连续加入进行，每次加入Triton B的比例为Triton B与苯扎氯铵肝素重量比0.2:1至0.3:1。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述步骤c)中温度保持在25至35℃，优选地27至32℃。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述步骤c)包括连续三次加入Triton B，方法是在第一次加入后，维持反应6
‑
10小时直至第二次加入，在所述第二次加入后，维持反应12
‑
20小时直至第三次加入，在所述第三次加入后，维持反应6
‑
10小时。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述步骤d)中每次使用H2O2处理采用的比例为每千克解聚肝素使用0.04至0.5升质量浓度为33％的H2O2，优选地每千克解聚肝素使用0.04至0.3升质量浓度为33％的H2O2。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述步骤d)在20至50℃温度条件下完成，优选地在25至45℃之间。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述步骤d)包括两次处理，第一次处理使用H2O2处理所述步骤c)中获得的解聚肝素，比例为每千克解聚肝素使用0.05至0.25升质量浓度为33％的H2O2，第二次处理使用H2O2的比例为每千克解聚肝素使用0.04至0.25升质量浓度为33％的H2O2。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述每次H2O2处理之...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：罗维实验室制药股份公司，
类型：发明
国别省市：