一种酮还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酮还原酶突变体，该酮还原酶突变体可以将3,4

【技术实现步骤摘要】
一种酮还原酶突变体及其应用

：
[0001]本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种酮还原酶突变体，可以用于制备去甲肾上腺素和肾上腺素的中间体(R)
‑
3,4
‑
二羟基
‑2’‑
氯苯乙醇。

技术介绍
：
[0002]去甲肾上腺素(INN名称：Norepinephrine，也称Noradrenaline，缩写NE或NA)，旧称“正肾上腺素”，化学名(R)
‑4‑
(2
‑
氨基
‑1‑
羟基乙基)
‑
1,2
‑
苯二酚，是肾上腺素去掉N
‑
甲基后形成的物质，在化学结构上也属于儿茶酚胺。去甲肾上腺素是一种抗休克的血管活性药，主要用于抢救急性低血压和周围血管扩张所引起的休克等。
[0003]专利CN111019981A中公开利用脱氢还原酶催化去甲肾上腺素酮获得去甲肾上腺素(Scheme1所示)。但没有公布对应的基因信息和转化后产物的手性值，转化底物浓度仅为25g/L。
[0004][0005]肾上腺素可以用于心脏骤停、支气管哮喘、过敏性休克，也可治疗荨麻疹、枯草热及鼻粘膜或齿龈出血等。
[0006]专利CN101906457B中公开用乙醇脱氢酶催化肾上腺素酮合成肾上腺素，但催化底物浓度仅有21g/L，难以工业化应用。
[0007]本专利技术为了实现酶法高效催化合成手性肾上腺素和去甲肾上腺素的中间体，选择了以3,4
‑
二羟基
‑2’‑
氯苯乙酮为底物，在酮还原酶作用下生成(R)
‑
3,4
‑
二羟基
‑2’‑
氯苯乙醇，进而可以制备去甲肾上腺素和肾上腺素。
[0008]文献Tetrahedron:Asymmetry,2007,18,1799
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1803中公开了一种醇脱氢酶YMR226c，可以将3,4
‑
二羟基
‑2’‑
氯苯乙酮转化为(R)
‑
3,4
‑
二羟基
‑2’‑
氯苯乙醇，但是ee值仅为97％，转化底物浓度仅为2.37g/L。
[0009]因此，我们需要对现有的酮还原酶进行改造，提高催化底物浓度、转化率以及ee值等，进而大幅度降低去甲肾上腺素和肾上腺素的制备成本。

技术实现思路
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[0010]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的酮还原酶突变体。
[0011]一方面，本专利技术利用蛋白质工程技术对来源于Lactobacillus kefiri的酮还原酶进行改造，获得3个高催化效率的酮还原酶突变体A、B和C。
[0012]进一步，所述酮还原酶突变体A、B和C的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、5和7所示。
[0013]更进一步，所述酮还原酶突变体A是在野生型序列基础上将部分位点进行突变，具体为：第64位点为Val，第76位点为Ile，第88位点为Gly，第95位点为Met，第96位点为Ile，第99位点为Leu，第100位点为Gly，第117位点为Ala，第143位点为Ser，第145位点为Ala，第147位点为Ile，第153位点为Met，第156位点为Tyr，第159位点为Thr，第160位点为Lys，第190位点为Ala，第197位点为Ala，第200位点为Pro，第202位点为Phe，第206位点为Cys。
[0014]更进一步，所述酮还原酶突变体B是在酮还原酶突变体A的序列基础上进行取代、缺失获得。
[0015]更进一步，酮还原酶突变体C是在酮还原酶突变体B的基础上进行多段Loop的敲除后获得的。
[0016]更进一步，所述酮还原酶突变体来源于野生型Lactobacillus kefiri，野生型模板NCBI的登录号为4RF2_A。
[0017]进一步，所述酮还原酶突变体在体外构建到重组表达载体上，优选PET系列载体。
[0018]进一步，所述酮还原酶突变体的宿主细胞为大肠杆菌，所述细胞为BL21(DE3)、PLysS或Origami B(DE3)。
[0019]进一步，经过宿主细胞的在IPTG诱导下的表达后，可以获得以上三株突变体的蛋白，为了提升酮还原酶突变体的利用率，可直接利用发酵后的全细胞进行后期底物催化。
[0020]另一方面，本专利技术提供的酮还原酶突变体可以将3,4
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二羟基
‑2’‑
氯苯乙酮转化为(R)
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3,4
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二羟基
‑2’‑
氯苯乙醇，采用的技术方案如下：
[0021][0022]进一步，所述3,4
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二羟基
‑2’‑
氯苯乙酮浓度可达120g/L。
[0023]进一步，所述酮还原酶突变体为酮还原酶酶粉或含有该酮还原酶的全细胞或细胞破碎液，优选酮还原酶全细胞。
[0024]进一步，所述反应中需要加入辅酶体系，优选NADPH。
[0025]进一步，所述反应利用酮还原酶突变体的逆向反应，以异丙醇为底物实现了辅酶NADPH的再生。
[0026]更进一步，所述反应中异丙醇的浓度控制在20％～40％之间。
[0027]进一步，所述反应的反应温度控制在25～45℃，优选37℃。
[0028]进一步，所述反应的pH控制在5.0～7.5之间，优选6.0。
[0029]本专利技术的有益效果在于，本专利技术提供了一种新的酮还原酶突变体，转化底物浓度高达120g/L，转化率95.5％以上，手性ee值>99％。
[0030]使得肾上腺素和去甲肾上腺素的制备成本有了大幅度降低，同时实现了绿色化生产。
具体实施方式
[0031]下面结合具体实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本专利技术的内容，但本专利技术的保护范围不限于此。
[0032]实施例1酮还原酶的构建
[0033]从NCBI网站获取来源于Lactobacillus kefiri的酮还原酶野生型基因序列，利用引物设计软件Primer 5，设计出两条上下游引物，分别含有限制性内切酶NdeI和XhoI的切割位点，具体引物信息见表1。
[0034]表1 PCR扩增的引物序列
[0035]引物名称引物序列(5
’→3’
)NdeI
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上游引物TACGGCTAGCATGACTGATCGTTTAAAAGGXhoI
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下游引物CATGCTCGAGTTATTGAGCAGTGTATCCACC
[0036]根据PCR扩增原理，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase聚合酶的扩增能力，在上下游引物的参与下，借助PCR仪器合成目的基因。具体的PCR体系和扩增条件见表2和表3，经过约2h的扩增后，进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、5和7所示。2.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4、6和8所示。3.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体表达于BL21(DE3)、PLysS或...

【专利技术属性】
技术研发人员：竺伟，张小飞，马斌祥，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：